分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定牛肉干中苯并(α)芘的含量

◎ 尹安胤

（云南省德宏州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 德宏 678400）

苯并芘（Benzopyrene）是一類含苯環(huán)的稠環(huán)芳烴，根據(jù)苯環(huán)的稠合位置不同，苯并芘有多種異構(gòu)體，其中苯并(α)芘（BaP）是最常見的一種，也是多環(huán)芳烴中毒性最大的一種強(qiáng)致癌物，是世界衛(wèi)生組織確定的三大強(qiáng)致癌物（黃曲霉毒素、亞硝胺、苯并芘）之一[1]。苯并(α)芘廣泛存在于煙熏、油炸、燒烤、烘焙等食品中，主要是由于食品中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪在不完全燃燒時(shí)產(chǎn)生的[2]。人體長期攝入含并(α)芘的食品會對健康造成巨大威脅，在歷年的《國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》中都將其列為重點(diǎn)檢測項(xiàng)目。

火燒牛肉干巴是云南省德宏州傣族人民的一種風(fēng)味休閑食品，深受當(dāng)?shù)厝藗兿矏邸ＥＨ飧稍诩庸み^程中經(jīng)炭火高溫烤制會產(chǎn)生一定量的苯并(α)芘。GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定了肉及肉制品中苯并(α)芘的限量為5.0 μg·kg-1[3]。

目前，苯并(α)芘的檢測方法主要采用GB 5009.27—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯并(α)芘的測定》中的高效液相色譜法[4]，其中樣品凈化處理方法有中性氧化鋁柱凈化法和分子印跡柱凈化法。分子印跡柱凈化法是采用分子印跡技術(shù)的原理，模擬免疫學(xué)中抗原抗體反應(yīng)模式，將樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行特異性提純處理和富集。由于分子印跡聚合物（MIP）具有從復(fù)雜樣品中選擇性地吸附模板分子的能力，因此它非常適合用作固相萃取劑來分離和富集復(fù)雜樣品中的痕量被分析物，可有效提高分析的精密度和準(zhǔn)確性[5]。本文采用分子印跡固相萃取凈化技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法，建立了牛肉干中苯并(α)芘的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（RF-20A熒光檢測器），日本島津；XT-NS1全自動定量濃縮儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；HS-6150超聲波清洗器，天津市恒奧科技有限公司；BS1254電子天平，德國賽多利斯股份有限公司；Maxi Mix II渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技有限公司；甲醇中苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（10.0 μg·mL-1），中國計(jì)量科學(xué)研究院；0.22 μm針式濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；二氯甲烷（色譜純）、正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純），默克化工技術(shù)（上海）有限公司；超純水機(jī)，密理博中國有限公司；中性氧化鋁柱（ProElut BAP 22 g/60 mL）、分子印跡柱（ProElut BAP-MIP 500 mg/6 mL），迪馬科技（天津）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

牛肉干購自本地超市，生產(chǎn)單位為德宏州本地某食品企業(yè)。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo HYPERSIL Green PAH多環(huán)芳烴分析專用柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈∶水（88∶12）；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測器激發(fā)波長：384 nm，發(fā)射波長：406 nm。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的提取

準(zhǔn)確稱取1 g（精確到0.001 g）均勻試樣于50.0 mL離心管中，加入5 mL正己烷，旋渦混合1 min，超聲10 min，于5 000 r·min-1離心5 min，取上清液于玻璃燒杯中，再加入5 mL正己烷重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。分別用2種BaP專用固相萃取柱進(jìn)行凈化處理。

1.4.2 樣品的凈化

（1）中性氧化鋁柱凈化（ProElut BAP 22 g/60 mL）。先用30 mL正己烷活化柱子，棄去流出液并保持濕潤。將待凈化液全部轉(zhuǎn)移至SPE小柱中，并用2 mL正己烷清洗燒杯并轉(zhuǎn)移至小柱。控制流速，收集凈化液于氮吹管中，再加入50 mL正己烷洗脫，繼續(xù)收集凈化液。將凈化液在40 ℃濃縮儀中氮吹至干，準(zhǔn)確加入1 mL乙腈旋渦復(fù)溶，用0.22 μm針式濾膜過濾至色譜進(jìn)樣小瓶中供液相色譜測定，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較，外標(biāo)法定量。

（2）分子印跡柱凈化（ProElut BAP-MIP 500 mg/6 mL）。依次加入5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化柱子，將待凈化液轉(zhuǎn)移至SPE小柱，并用2 mL正己烷清洗燒杯并轉(zhuǎn)移至小柱。控制流速，待樣液過完后，用6 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液，再加入6 mL二氯甲烷洗脫并收集洗脫液至氮吹管中。將凈化液在40 ℃濃縮儀中氮吹至干，準(zhǔn)確加入1 mL乙腈旋渦復(fù)溶，用0.22 μm針式濾膜過濾至色譜進(jìn)樣小瓶中供液相色譜測定，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較，外標(biāo)法定量。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。確吸取1.0 mL苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（10.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中并用乙腈定容，配制成1.0 μg·mL-1的中間液，再用乙腈稀釋得到0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。將工作溶液注入液相色譜中，按照1.3中的色譜條件進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化方法的選擇

本文對中性氧化鋁柱凈化法和分子印跡柱凈化法分別從凈化分離效果和加標(biāo)回收率進(jìn)行了比較，樣品色譜圖見圖1和圖2，加標(biāo)回收率見表1。通過實(shí)驗(yàn)得知，分子印跡柱凈化法色譜圖雜峰較少、峰型對稱、基線平穩(wěn)、回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且樣品凈化過程中操作較為簡單快速、有機(jī)試劑消耗少，對實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境較為友好。因此，分子印跡柱凈化法優(yōu)于中性氧化鋁柱凈化法，是測定牛肉干中苯并(α)芘的首選前處理方法。

圖1 中性氧化鋁柱凈化法樣品色譜圖

圖2 分子印跡柱凈化法樣品色譜圖

表1 中性氧化鋁柱和分子印跡柱回收率表

2.2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

由 圖3和 圖4知，苯 并（a）芘 濃 度 在0.5～20.0 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，苯并（a）芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=4.307×10-6X+0.288，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。隨試樣同時(shí)做空白試驗(yàn)，以3倍信噪比計(jì)算出檢出限為0.2 μg·kg-1。

圖3 苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖4 苯并(α)芘標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖

2.3 精密度與回收率實(shí)驗(yàn)

選取一個(gè)加標(biāo)樣品按照分子印跡柱方法凈化處理后重復(fù)測定6次，根據(jù)苯并（a）芘峰面積計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2，平均峰面積為318 540，RSD為1.44%。用已知苯并（a）芘含量的牛肉干樣品制備3個(gè)添加水平的加標(biāo)樣品：1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1，每個(gè)水平制備6個(gè)平行樣，按照分子印跡柱凈化方法步驟處理后上機(jī)測定，分別計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表3。平均回收率的范圍為90.3%～95.4%，RSD為0.55%～2.36%。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)論

本文建立了牛肉干中苯并（a）芘的分子印跡固相萃取-高效液相色譜分析方法，并通過實(shí)驗(yàn)比較了分子印跡柱和中性氧化鋁柱的凈化分離效果及回收率。實(shí)驗(yàn)表明，分子印跡固相萃取柱能選擇性地識別和富集苯并芘，具有操作簡便、快速、有機(jī)試劑消耗少、穩(wěn)定性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足牛肉干中苯并（a）芘含量的快速測定。