分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定牛肉干中苯并(α)芘的含量

◎ 尹安胤

（云南省德宏州質量技術監督綜合檢測中心，云南 德宏 678400）

苯并芘（Benzopyrene）是一類含苯環的稠環芳烴，根據苯環的稠合位置不同，苯并芘有多種異構體，其中苯并(α)芘（BaP）是最常見的一種，也是多環芳烴中毒性最大的一種強致癌物，是世界衛生組織確定的三大強致癌物（黃曲霉毒素、亞硝胺、苯并芘）之一[1]。苯并(α)芘廣泛存在于煙熏、油炸、燒烤、烘焙等食品中，主要是由于食品中的碳水化合物、蛋白質和脂肪在不完全燃燒時產生的[2]。人體長期攝入含并(α)芘的食品會對健康造成巨大威脅，在歷年的《國家食品安全監督抽檢實施細則》中都將其列為重點檢測項目。

火燒牛肉干巴是云南省德宏州傣族人民的一種風味休閑食品，深受當地人們喜愛。牛肉干在加工過程中經炭火高溫烤制會產生一定量的苯并(α)芘。GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》規定了肉及肉制品中苯并(α)芘的限量為5.0 μg·kg-1[3]。

目前，苯并(α)芘的檢測方法主要采用GB 5009.27—2016《食品安全國家標準 食品中苯并(α)芘的測定》中的高效液相色譜法[4]，其中樣品凈化處理方法有中性氧化鋁柱凈化法和分子印跡柱凈化法。分子印跡柱凈化法是采用分子印跡技術的原理，模擬免疫學中抗原抗體反應模式，將樣品中的目標化合物進行特異性提純處理和富集。由于分子印跡聚合物（MIP）具有從復雜樣品中選擇性地吸附模板分子的能力，因此它非常適合用作固相萃取劑來分離和富集復雜樣品中的痕量被分析物，可有效提高分析的精密度和準確性[5]。本文采用分子印跡固相萃取凈化技術結合高效液相色譜法，建立了牛肉干中苯并(α)芘的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀（RF-20A熒光檢測器），日本島津；XT-NS1全自動定量濃縮儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；HS-6150超聲波清洗器，天津市恒奧科技有限公司；BS1254電子天平，德國賽多利斯股份有限公司；Maxi Mix II渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技有限公司；甲醇中苯并(α)芘標準物質（10.0 μg·mL-1），中國計量科學研究院；0.22 μm針式濾膜，天津津騰實驗室設備有限公司；二氯甲烷（色譜純）、正己烷（色譜純）、乙腈（色譜純），默克化工技術（上海）有限公司；超純水機，密理博中國有限公司；中性氧化鋁柱（ProElut BAP 22 g/60 mL）、分子印跡柱（ProElut BAP-MIP 500 mg/6 mL），迪馬科技（天津）有限公司。

1.2 實驗樣品

牛肉干購自本地超市，生產單位為德宏州本地某食品企業。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo HYPERSIL Green PAH多環芳烴分析專用柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈∶水（88∶12）；進樣量：20 μL；熒光檢測器激發波長：384 nm，發射波長：406 nm。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品的提取

準確稱取1 g（精確到0.001 g）均勻試樣于50.0 mL離心管中，加入5 mL正己烷，旋渦混合1 min，超聲10 min，于5 000 r·min-1離心5 min，取上清液于玻璃燒杯中，再加入5 mL正己烷重復提取一次，合并兩次上清液。分別用2種BaP專用固相萃取柱進行凈化處理。

1.4.2 樣品的凈化

（1）中性氧化鋁柱凈化（ProElut BAP 22 g/60 mL）。先用30 mL正己烷活化柱子，棄去流出液并保持濕潤。將待凈化液全部轉移至SPE小柱中，并用2 mL正己烷清洗燒杯并轉移至小柱。控制流速，收集凈化液于氮吹管中，再加入50 mL正己烷洗脫，繼續收集凈化液。將凈化液在40 ℃濃縮儀中氮吹至干，準確加入1 mL乙腈旋渦復溶，用0.22 μm針式濾膜過濾至色譜進樣小瓶中供液相色譜測定，與標準系列比較，外標法定量。

（2）分子印跡柱凈化（ProElut BAP-MIP 500 mg/6 mL）。依次加入5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化柱子，將待凈化液轉移至SPE小柱，并用2 mL正己烷清洗燒杯并轉移至小柱。控制流速，待樣液過完后，用6 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液，再加入6 mL二氯甲烷洗脫并收集洗脫液至氮吹管中。將凈化液在40 ℃濃縮儀中氮吹至干，準確加入1 mL乙腈旋渦復溶，用0.22 μm針式濾膜過濾至色譜進樣小瓶中供液相色譜測定，與標準系列比較，外標法定量。

（3）標準曲線的繪制。確吸取1.0 mL苯并(α)芘標準物質（10.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中并用乙腈定容，配制成1.0 μg·mL-1的中間液，再用乙腈稀釋得到0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的標準系列工作溶液。將工作溶液注入液相色譜中，按照1.3中的色譜條件進行測定，以標準系列工作液的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到標準曲線回歸方程。

2 結果與分析

2.1 凈化方法的選擇

本文對中性氧化鋁柱凈化法和分子印跡柱凈化法分別從凈化分離效果和加標回收率進行了比較，樣品色譜圖見圖1和圖2，加標回收率見表1。通過實驗得知，分子印跡柱凈化法色譜圖雜峰較少、峰型對稱、基線平穩、回收率高，結果準確可靠，且樣品凈化過程中操作較為簡單快速、有機試劑消耗少，對實驗人員和環境較為友好。因此，分子印跡柱凈化法優于中性氧化鋁柱凈化法，是測定牛肉干中苯并(α)芘的首選前處理方法。

圖1 中性氧化鋁柱凈化法樣品色譜圖

圖2 分子印跡柱凈化法樣品色譜圖

表1 中性氧化鋁柱和分子印跡柱回收率表

2.2 線性范圍、相關系數和檢出限

由 圖3和 圖4知，苯 并（a）芘 濃 度 在0.5～20.0 ng·mL-1范圍內呈良好線性關系，苯并（a）芘的標準曲線回歸方程為Y=4.307×10-6X+0.288，相關系數r=0.999 6。隨試樣同時做空白試驗，以3倍信噪比計算出檢出限為0.2 μg·kg-1。

圖3 苯并(α)芘標準色譜圖

圖4 苯并(α)芘標準曲 線圖

2.3 精密度與回收率實驗

選取一個加標樣品按照分子印跡柱方法凈化處理后重復測定6次，根據苯并（a）芘峰面積計算出相對標準偏差（RSD），結果見表2，平均峰面積為318 540，RSD為1.44%。用已知苯并（a）芘含量的牛肉干樣品制備3個添加水平的加標樣品：1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1，每個水平制備6個平行樣，按照分子印跡柱凈化方法步驟處理后上機測定，分別計算回收率和RSD，結果見表3。平均回收率的范圍為90.3%～95.4%，RSD為0.55%～2.36%。

表2 精密度試驗結果表

表3 回收率試驗結果表

3 結論

本文建立了牛肉干中苯并（a）芘的分子印跡固相萃取-高效液相色譜分析方法，并通過實驗比較了分子印跡柱和中性氧化鋁柱的凈化分離效果及回收率。實驗表明，分子印跡固相萃取柱能選擇性地識別和富集苯并芘，具有操作簡便、快速、有機試劑消耗少、穩定性好、回收率高等優點，能夠滿足牛肉干中苯并（a）芘含量的快速測定。