冰片阿司匹林固體脂質納米粒的制備及腦靶向分布*

付麗娜，趙 寧，李偉澤，韓文霞，李 健，余可嘉

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

腦卒中是一類嚴重危害人類生命健康的疾病，中國新發腦卒中患者每年高達200萬，其中缺血性腦卒中約占80%[1-3]。長時間的缺氧將導致不可逆的損傷，因此溶栓療法是臨床上治療缺血性腦卒中的有效方法，但受限于較短的時間窗3～4.5 h，超出時間窗則療效不佳[4-6]。

阿司匹林(ASP)是應用最廣泛的抗血小板凝集藥物，常用于心腦血管疾病，在缺血性腦卒中的治療中起到重要作用。此外，ASP還可以保護中老年人的腦部神經，抑制中樞神經系統的炎癥反應，避免神經元的損傷，與其他藥物聯合可有效治療老年癡呆病癥等[7]。但是，ASP的化學性質不穩定，易水解，且透過血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的能力低因而影響了對缺血性腦卒中以及其他腦部疾病的療效。因此，設計開發提高ASP穩定性的腦靶向給藥系統顯得尤為重要。

中醫理論認為芳香開竅藥善于走竄，能通竅開閉、蘇醒神識，因此常用于治療心腦血管藥物。冰片(BO)是常用的芳香開竅藥之一，具有“芳香之性走竄”，具有引藥上行之功效；現代研究表明，BO可以促進許多藥物透過BBB進入腦組織[8-9]，還能促進活細胞、脂質體等透過BBB[10]。BO誘導BBB開放為生理性開放，不會引起腦的病理性損害且有一定的保護作用。固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是一種新型納米給藥系統[11-12]，主要以固態天然脂質如卵磷脂或合成類脂如三酰甘油等為載體，將藥物包裹或鑲嵌于納米粒的骨架中可提高藥物的載藥量和穩定性；同時，由于其基質材料的親脂性特征與納米尺寸的特性，SLN能夠提高藥物通過體內生物膜的滲透性、控制藥物的釋放以及實現藥物靶向轉運[13-14]。目前，尚未見到將ASP(或ASP與BO)制成SLN的報道，因此，實驗研究探討BO對ASP制成SLN后的性能與腦靶向分布的影響，從而為ASP腦靶向給藥系統的設計提供了依據。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

健康昆明種小鼠：批號20190505，112只[雌雄各半，體重(20±5)g]，購自西安交通大學醫學部。

阿司匹林：批號20170723，華陰市錦前程藥業有限公司；冰片：批號20170712，山東濱州智源生物科技有限公司；阿司匹林標準品：批號100113-201803，中國食品藥品檢定研究院；單硬脂酸甘油酯：西安小草植物科技責任有限公司；大豆卵磷脂：上海太偉藥業有限公司；膽固醇：安徽科寶生物工程有限公司；硫酸魚精蛋白：梯希愛化成工業發展有限公司；乙腈、甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；冰醋酸：天津市富宇精細化工有限公司；肝素鈉注射液：批號20170305，常州千紅生化制藥。

高效液相色譜儀(HPLC)：Agilent1260，美國安捷倫科技有限公司；光子相關光譜儀(PCS)：ZEN-3600，英國馬爾文公司；掃描電鏡(SEM)：Verios 460，美國FEI公司；透射電鏡(TEM)：JEM-2000EX，日本電子株式會社；恒溫加熱磁力攪拌器：B11-1，上海司樂儀器有限公司；離心機：SIGMA1-14，分析天平：Quintix224-1CN，賽多斯科學儀器公司；氮吹儀：JOYN-DCY-125，上海喬躍電子有限公司；渦旋振蕩儀：QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；超聲儀：KQ-5200E，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ASP測定方法的建立

1.2.1.1 樣品預處理

(1)血樣。各組動物取血1 mL，n=3 000 r/min離心10 min，吸取血漿0.1 mL，加入甲醇300 μL，渦旋振蕩1 min后，n=13 000 r/min離心10 min，取上清液；在40 ℃水浴下，氮氣吹干，殘留物用500 μL的流動相[乙腈-φ(冰醋酸)=5%水溶液(體積比為20∶80)]復溶，渦旋混勻1 min，n=13 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

(2)腦組織樣品。取血后處死小鼠，仔細分離腦組織并稱量，加入1.5倍量生理鹽水，勻漿，n=3 000 r/min離心10 min，取500 μL腦勻漿液，其余操作同上。

1.2.1.2 測定方法

采用HPLC測定ASP質量濃度。色譜柱：Hyper-sil BDS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-φ(冰醋酸)=5%水溶液(體積比為20∶80)；檢測波長：303 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min。

稱取ASP對照品8.000 mg，精密稱定后置于2 mL的棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用乙腈分別稀釋成ρ(ASP)=40、80、125、250、500、1 000 μg/mL的標準品溶液；取各標準品溶液20 μL，注入HPLC中測定，并以峰面積A為縱坐標、以質量濃度ρ為橫坐標進行線性回歸。

1.2.2 AB-SLN的制備及藥劑學性質考察

1.2.2.1 AB-SLN的制備

采用微乳-低溫固化法。稱取處方量ASP與BO置于乳缽中研勻，并與0.15 g單硬脂酸甘油酯、0.3 g大豆磷脂混合，加入5 mL無水乙醇，密閉，于70 ℃水浴溶解作為油相；稱取0.2 g普朗尼克F-68，加入10 mL純化水于70 ℃水浴溶解作為水相；n=1 000 r/min，將水相緩慢加入油相，攪拌30 min，得初乳并將其分散至45 mL冷水中，攪拌固化20 min，再高速勻質5 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得AB-SLN。同法，不加BO制備A-SLN。

1.2.2.2 AB-SLN藥劑學性質

取AB-SLN樣品適量，稀釋后注入PCS測定脂質體微粒的粒徑與Zeta電位；取AB-SLN樣品適量，稀釋后滴于硅晶片上，真空干燥后，在SEM下進行外觀形態觀察。

1.2.2.3 包封率測定

精密量取AB-SLN樣品1.0 mL置于2 mL離心管，加同體積魚精蛋白溶液(10 mg/mL)，混勻，靜置3 min，t=10 ℃、n=13 000 r/min離心10 min，沉淀用φ(Triton X-100)=12%溶液消解至澄清，取20 μL進樣，按照公式(1)計算包封率。

包封率=(m包封/m總)×100%

(1)

式中：m包封為被SLN包封的藥量，g；m總為實際加入的總藥量，g。

1.2.2.4 穩定性考察

取AB-SLN樣品適量，室溫條件下放置14 d，按照1.2.2.3方法測定AB-SLN的包封率，考察AB-SLN的穩定性。

1.2.3 AB-SLN的體內藥動學研究

將實驗動物隨機分為4組，AB-SLN-1[m(BO)∶m(ASP)=1∶1]，AB-SLN-2[m(BO)∶m(ASP)=3∶1]，AB-SLN-3[m(BO)∶m(ASP)=5∶1]，A-SLN(不含BO)，每組28只(雌雄各半)，按照ASP給藥劑量20 mg/kg，給予各組動物分別灌胃給藥各受試樣品；給藥后，各組分別于0、0.25、0.5、1、2、3、4和6 h取小鼠血樣及腦樣，按照1.2.1.1方法處理，并測定分析，考察不同質量濃度冰片對ASP入小鼠血液及腦漿作用的影響。

2 結果與討論

2.1 ASP測定方法的建立

2.1.1 標準曲線繪制

分別將ASP標準品溶液按照1.2.1.2方法進樣測定，得標準曲線y=2.944 2x-100.76，R2=0.999 7，線性范圍40～1 000 μg/mL，表明線性關系良好。

2.1.2 方法學考察

取小鼠空白及灌胃給藥的血漿、腦組織樣品，分別加入ρ(ASP)=250 μg/mL標準品溶液，按照1.2.1.1方法操作、1.2.1.2方法測定，色譜圖見圖1，表明在該色譜條件下內源性雜質不干擾ASP的測定。

圖1 阿司匹林HPLC圖譜

2.1.3 精密度測定

精密量取ρ(ASP)=1 000、250、40 μg/mL標準品溶液，按照1.2.1.2色譜條件每天(0、2、4、6、8和10 h)進樣，測定A值，其RSD小于2.5%，表明測定方法的精密度良好。

2.1.4 穩定性考察

取小鼠空白血漿、腦組織樣，分別加入ρ(ASP)=250 μg/mL標準品溶液，按照1.2.1.1方法操作，分別取10 μL上清液，按照1.2.1.2色譜條件在1 d內(1、2、4、6和12 h)進樣測定A值，其RSD分別為3.82%(n=5)和2.14%(n=5)，表明測定方法的穩定性良好。

2.1.5 回收率實驗

量取ASP的高、中、低3個質量濃度的對照品溶液，按照1.2.1.1方法操作，按照1.2.1.2色譜條件測定，通過對照品測得量與加入量之比計算回收率。結果血漿中樣品的回收率分別為92.54%、98.20%、94.52%，其RSD為3.02%；腦組織中樣品回收率分別為95.04%、94.61%、97.63%，其RSD為1.71%。

2.2 AB-SLN藥劑學性質考察結果

2.2.1 粒徑與Zeta電位

AB-SLN注入PCS后測定結果見圖2。

d/nma 粒徑

E/mVb 電位圖2 AB-SLN粒徑電位圖

由圖2可知，AB-SLN粒徑為(195±12)nm，PDI為0.162，表明粒度分布均勻；表面Zeta電位為(-32±2.7)mV。有研究表明，當納米粒的表面Zeta電位絕對值大于30 mV時，可顯著提高其物理穩定性且利于粒徑保持均勻[15]。

2.2.2 外觀形態

通過SEM和TEM觀察AB-SLN，結果見圖3。

a SEM

b TEM圖3 AB-SLN電鏡圖

由圖3可知，AB-SLN在電鏡下呈均勻的圓球狀結構，用TEM進行形態結構觀察，結果表明AB-SLN在電鏡下呈均勻的圓球狀結構。

2.2.3 包封率

AB-SLN對ASP的包封率測定結果為(76±5.2)%，表明AB-SLN包封率良好。

2.2.4 穩定性考察

AB-SLN在室溫條件下放置14 d，包封率為0 d時的98.4%，表明AB-SLN穩定性較好，能夠避免ASP的水解而提高其穩定性。

2.3 AB-SLN的體內藥動學研究結果

AB-SLN的體內藥動學研究結果見圖4(n=4)、圖5(n=4)。

t/h圖4 ASP的血藥濃度圖

由圖4可知，A-SLN組的藥峰濃度(Cm)分別為AB-SLN-1、AB-SLN-2與AB-SLN-3的1.58、1.79與2.07倍，表明A-SLN遞送ASP主要分布聚集在血液中；A-SLN組的藥峰時間為tm=0.5 h，而加入BO后的AB-SLN-1、AB-SLN-2與AB-SLN-3的藥峰時間為tm=3 h，可能是因為加入BO后促進了藥物ASP先進入腦組織，從而導致ASP在血液中藥峰時間延遲。

t/h圖5 ASP的腦藥濃度圖

由圖5可知，AB-SLN-1、AB-SLN-2與AB-SLN-3在腦組織中的藥峰時間為tm=1 h，而A-SLN組的tm=2 h，并且AB-SLN-1、AB-SLN-2與AB-SLN-3的Cm分別為A-SLN組的1.94、2.55與2.71倍，結果表明BO能夠促進藥物ASP進入腦組織，AB-SLN具有確切的腦靶向作用。ASP各給藥系統均在達到峰濃度Cm以后，w(腦藥)緩慢降低并同比顯著高于A-SLN組，表明AB-SLN比A-SLN具有更好的緩釋效果，可有效延長治療時間。

3 結 論

采用微乳-低溫固化法制備的AB-SLN外觀呈均勻的圓球狀粒狀結構，其粒徑為(195±12)nm，表面Zeta電位為(-32±2.7)mV；SLN形成的骨架結構對藥物具有良好的包載作用，藥物BO-ASP的包封率達到(76±5.2)%，由于藥物被包埋于SLN骨架結構中避免了與外界環境的接觸，因而提高了藥物的穩定性，AB-SLN在室溫放置14 d，包封率仍為0 d時的98.4%。藥動學實驗證實，當加入BO后AB-SLN在腦組織中的藥峰時間tm比A-SLN組提前，且在腦組織中的達峰藥物濃度Cm高于A-SLN組，表明AB-SLN能夠促進藥物ASP進入腦組織而實現腦靶向和緩釋作用。綜上，AB-SLN為ASP腦部疾病的治療提供了一種新型腦靶向給藥系統，具有一定的科學意義和廣闊的臨床應用前景。