肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素及其血清miRNA-122與預后關系

劉海云，吳 艷，沈愛武，王 霞

肝硬化是臨床常見肝臟疾病，病因以病毒性肝炎最為常見，隨著病情進展，患者可因門脈高壓和食管胃底靜脈曲張破裂引發上消化道出血，并引起嚴重繼發感染，而繼發感染不僅增加了治療成本及難度，還提高了病死率，故尋找與此類患者預后相關的指標以指導臨床干預具有重要意義[1]。miRNA是一類小型內源性非編碼RNA分子，可通過與信使RNA結合影響蛋白編碼基因表達，進而參與細胞增殖、分化和凋亡等病理生理過程[2]。miRNA-122為在肝組織中表達最豐富的一種miRNA分子。有研究顯示，miRNA-122表達與乙型肝炎病毒相關性肝癌發生和發展密切相關，對肝癌診斷及預后評估有一定價值[3]。還有研究報道，miRNA-122與膿毒癥休克合并肝損傷患者病情及預后相關[4]。然而，目前臨床關于miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者的影響尚不清楚。本研究探討肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素及其血清miRNA-122與預后關系，現報告如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年6月—2021年3月如皋市人民醫院收治的肝硬化上消化道出血合并細菌感染80例作為感染組。納入標準：①符合肝硬化診斷標準[5]，且經臨床表現和影像學檢查診斷為上消化道出血；②符合細菌感染診斷標準[6]；③年齡>18歲；④接受規范治療；⑤患者和(或)其家屬簽署相關知情同意書。排除標準：①合并惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病、血液系統疾病和獲得性免疫缺陷綜合征等嚴重影響預后疾??；②入院后48 h內死亡；③合并真菌感染；④精神障礙；⑤治療依從性差。另選取同期該院收治未合并細菌感染的肝硬化上消化道出血80例作為非感染組，除細菌感染診斷外納入及排除標準與感染組一致。本研究經醫院醫學倫理委員會批準同意執行。

1.2方法

1.2.1一般資料收集：收集所有入選患者一般資料，包括性別、年齡、體質量指數、肝硬化病因、肝硬化病程、肝硬化分期、Child肝功能分級、出血嚴重程度(出血量<500 ml和≥500 ml分別為輕度和中重度)[7]、腹腔積液、急性生理與慢性健康狀況評分系統Ⅱ(APACHEⅡ)評分[8]及入院時血紅蛋白、血小板、白蛋白水平。

1.2.2血清miRNA-122檢測：采集所有入選患者入院后第2天清晨空腹肘靜脈血5 ml，于4 ℃下3000 r/min離心15 min，收集上清液，于-80 ℃條件下保存備用。采用Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)從血清中提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作；于無菌條件下，采用NanoDrop 1000型紫外分光光度計(美國Nanodrop公司)檢測RNA純度，A260/A280值在1.8～2.0視為合格。采用實時熒光定量PCR法(美國BIO-RAD公司，C1000 Thermal cycler PCR儀)，以兩步法檢測miRNA-122，先使用逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)行逆轉錄，miRNA-122引物序列：上游引物5'-GACGTCGACTAAGAATGTGAAGGTGAAGTT-3'，下游引物5'-CACGGATCCACAAGATTGAGAAGACTAATA-3'，反應條件:37 ℃60 min、95 ℃3 min，獲得逆轉錄產物cDNA，采用SYBR premix EX taq試劑盒行樣品上樣；再行實時熒光定量PCR(試劑盒購自美國Invitrogen公司)，每個樣品設置3個重復孔，擴增條件：94 ℃預變性 3 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火 30 s，共40個循環，72 ℃終延伸5 min；以U6(美國Invitrogen公司)為內參基因，采用2-ΔΔCt定量分析miRNA-122相對表達量。

1.2.3預后評估[8]：根據住院28 d治療結果，將肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者分為好轉組(57例，治療后臨床癥狀和實驗室指標好轉，或治療后痊愈出院)和惡化組(23例，治療后臨床癥狀和實驗室指標無好轉甚至惡化，或住院期間死亡)兩組。

1.3觀察指標 采用單因素和多因素Logistic回歸分析探討肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素，分析肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級、APACHEⅡ評分相關性，比較好轉組和惡化組血清miRNA-122，探討血清miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后預測價值。

2 結果

2.1肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素單因素分析 單因素分析結果顯示，感染組肝硬化失代償期、Child肝功能分級B級或C級、中重度出血、有腹腔積液所占比例和APACHEⅡ評分、血清miRNA-122高于非感染組，入院時血紅蛋白和白蛋白低于非感染組(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素單因素分析

2.2肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素多因素Logistic回歸分析 以細菌感染為因變量，單因素分析中差異有統計學意義的影響因素為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示肝硬化失代償期、中重度出血、APACHEⅡ評分≥25分和血清miRNA-122≥2.4是肝硬化上消化道出血合并細菌感染的獨立危險因素，入院時白蛋白≥22 g/L是肝硬化上消化道出血合并細菌感染的保護因素(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素多因素Logistic回歸分析

2.3肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級、APACHEⅡ評分相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級、APACHEⅡ評分均呈正相關(r=0.391，P=0.002；r=0.286，P=0.021)。

2.4好轉組和惡化組血清miRNA-122比較 血清miRNA-122好轉組為2.38±0.55低于惡化組3.03±0.49(P<0.01)。

2.5血清miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后預測價值 受試者工作特征曲線分析結果顯示，血清miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后預測價值的曲線下面積為0.814(95%CI 0.713,0.914，P<0.001)，最佳截斷值為2.85，對應的敏感度和特異度分別為73.90%和78.90%，見圖1。

圖1 血清miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后預測價值的受試者工作特征曲線

3 討論

肝硬化患者因肝細胞受損，蛋白質合成能力下降，免疫功能較差，對細菌清除及防御能力下降，當門脈高壓引起胃腸淤血后，可損傷腸道黏膜屏障功能，引起腸道菌群移位，增加細菌感染風險[9]。有研究顯示，20%～40%的肝硬化上消化道出血患者可伴細菌感染[10]。夏文恬等[11]報道，肝硬化上消化道出血并發細菌感染主要影響因素為肝硬化失代償期、出血嚴重程度及住院時間；崔宏等[12]研究顯示，肝硬化合并腹腔感染以革蘭陰性菌為主，且對第三和四代頭孢菌素耐藥率較高。然而，現臨床上關于肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后評估的研究并不多見。本研究分析肝硬化上消化道出血合并細菌感染影響因素及其血清miRNA-122與預后關系，以期為此類患者預后評估及感染防控提供新的思路。

miRNA與多種疾病發生和發展密切相關，且血清miRNA不易被RNA酶降解，故血清miRNA成為多種疾病熱門生物學標志物[13]。miRNA-122位于染色體17q23.2的FRA17B脆性區域，有自主調控基因轉錄作用。有研究報道，miRNA-122可與陽離子氨基酸轉運蛋白(CAT-1)信使RNA結合，并通過抑制CAT-1合成來介導機體蛋白質合成障礙[14]。還有文獻報道，miRNA-122能與抗凋亡基因家族Bcl-2和Bcl-xL的信使RNA結合并抑制抗凋亡基因表達，進而加速細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，感染組血清miRNA-122高于非感染組，提示血清miRNA-122可能與肝硬化上消化道出血合并細菌感染有關。有研究報道，膿毒癥患者血清miRNA-122升高，其一方面通過抑制CAT-1合成加重機體蛋白質合成障礙;另一方面通過抑制抗凋亡基因表達來介導大量淋巴細胞凋亡，使機體獲得性免疫功能降低，從而引起難以控制的繼發性感染[16]。本研究多因素Logistic回歸分析結果顯示，血清miRNA-122≥2.4是肝硬化上消化道出血合并細菌感染的獨立危險因素，提示血清miRNA-122與肝硬化上消化道出血患者細菌感染相關。其機制可能與miRNA-122影響機體蛋白質合成和促進免疫細胞凋亡有關。

Child肝功能分級越高說明患者肝損傷越嚴重[17]。本研究結果顯示，肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者血清miRNA-122與Child肝功能分級呈正相關，提示血清miRNA-122與肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者肝損傷有關。有研究報道，血清miRNA-122升高與膿毒癥肝損傷有關[18]；還有文獻顯示，慢性丙型肝炎患者血清miRNA-122升高，升高程度與肝組織炎癥壞死程度有關[19]。本研究結果與上述研究結果相似。APACHEⅡ評分在重癥醫學科患者病情及預后評估中有重要作用，分值越高，病情越重，死亡風險越高[20]。本研究結果顯示，肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者血清miRNA-122與APACHEⅡ評分呈正相關，提示血清miRNA-122可能與肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者病情嚴重程度相關。本研究結果還顯示，血清miRNA-122好轉組低于惡化組，提示血清miRNA-122可能參與肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者病情進展。此外，本研究受試者工作特征曲線分析結果顯示，血清miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后預測價值的曲線下面積為0.814，最佳截斷值為2.85，提示血清miRNA-122對肝硬化上消化道出血合并細菌感染患者預后有一定預測價值。然而，本研究為單中心研究且樣本量有限，研究結果有待進一步研究驗證。

總之，血清miRNA-122是肝硬化上消化道出血合并細菌感染的影響因素，與其肝功能、病情嚴重程度呈正相關，對其預后有一定預測價值。