西藏白肉靈芝菌絲體發(fā)酵條件初探

高 磊

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850000）

靈芝，屬于常見的大型真菌。靈芝中主要的活性物質(zhì)為靈芝多糖和三萜，具備抗腫瘤、抗氧化、保肝護肝、調(diào)整免疫功能等很好的功效。由于人工栽培耗時久，因此采取液體進行發(fā)酵，從而獲得白肉靈芝菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物，合適的發(fā)酵條件可有效地促進菌絲體生長，提高菌絲體產(chǎn)量。本實驗主要從時間、碳源、氮源、pH 值等方面分別對白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試靈芝為西藏白肉靈芝，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所食用菌實驗室提供。供試培養(yǎng)基：①PDA培養(yǎng)基；②加富液體培養(yǎng)基、PDA基礎(chǔ)上添加蛋白胨0.2%、磷酸二氫鉀0.046%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、維生素B每1000 mL 0.03 mg；③液體培養(yǎng)基，不含瓊脂的PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種制備

斜面菌種（一級種）制備：選用實驗室保藏菌株試管斜面，通過轉(zhuǎn)管培養(yǎng)獲得。

液體菌種制備：使用容量為250 mL 的三角瓶，盛裝PDA 液體的液體培養(yǎng)基100 mL，無菌條件接入約0.5 cm × 0.5 cm 白肉靈芝一級種3 塊，使用恒溫搖床時，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、150 r/min，培養(yǎng)5 d，得到我們需要的液體菌種。

1.2.2 菌絲體干質(zhì)量測定方法

將獲得的液體菌種通過離心機，在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，去上清，用滅菌水反復(fù)清洗，再使用高速離心機，在3000 r/min 轉(zhuǎn)速下，離心10 min 后，使用吸水紙吸干水分，置于滅菌的平板內(nèi)，放置于60 ℃干燥箱烘干，使用精密電子天平稱質(zhì)量。

1.2.3 pH值測定

采用實驗室常用pH 計測量發(fā)酵后液體的pH值。

1.2.4 白肉靈芝菌絲體生長

曲線圖繪制過程，需要以250 mL 三角瓶作為培養(yǎng)耗材，并在其瓶內(nèi)加入加富液體培養(yǎng)基100 mL，共計30 瓶，使用壓力滅菌器進行高壓滅菌1 h。冷卻后在超凈工作臺中進行接種，然后在每個250 mL三角瓶中放入10 mL液體菌種，接種密封后，將其放置于恒溫搖床內(nèi)，置于25 ℃、150 r/min條件下進行培養(yǎng)。 1 d 后，每次取其中3 瓶，測量瓶內(nèi)液體的pH值和菌絲體干質(zhì)量，共觀察13 d。

1.2.5 白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵單因素實驗

單因素試驗中會使用到250 mL 三角瓶作為實驗儀器，裝液體培養(yǎng)基100 mL，在超凈工作臺中每個三角瓶中接入10 mL 液體菌種，將其放置于恒溫搖床內(nèi)，控制溫度為25 ℃、在轉(zhuǎn)速150 r/min 條件下培養(yǎng)6 d 后。測量其瓶內(nèi)液體的pH 值和菌絲干質(zhì)量。

1）C 因素試驗：選擇實驗室中比較常見的單糖（葡萄糖）、雙糖（蔗糖）、多糖（玉米粉、淀粉），對照組選擇不加任何碳源，通過測量三角瓶內(nèi)液體的菌絲體干質(zhì)量，得出不同C 源條件下白肉靈芝菌絲體生長的情況，共進行9個處理，每組實驗重復(fù)3次。

2）N 因素試驗：選擇實驗室中常見的無機氮（硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨）、有機氮（牛肉膏、酵母膏），選擇的N 源可分別替換PDA 培養(yǎng)基中的蛋白胨，對照組中不加任何N 源，通過測量三角瓶內(nèi)液體的菌絲體干質(zhì)量，得出不同N 源條件下白肉靈芝菌絲體生長的情況，共10 個處理，每組實驗重復(fù)3次。

3）pH 值試驗：用1.1 中提到的②號培養(yǎng)基，使用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值，設(shè)pH 值為4，5，6，7，8，9，10，11 共8 個實驗梯度，每個功能梯度可以重復(fù)3 次，通過分析儀器設(shè)備測得數(shù)據(jù)不同的pH值對白肉靈芝菌絲體生長產(chǎn)生的影響。

2 結(jié)果分析

2.1 白肉靈芝菌絲體生長曲線

根據(jù)實驗設(shè)計把培養(yǎng)時間作為橫坐標，菌絲干質(zhì)量作為縱坐標（圖1）。從圖1 可直觀看到，菌絲在加富培養(yǎng)基中進行菌種接種后，發(fā)現(xiàn)1 d 后菌絲生長速率進入增長期，其中生長期的適應(yīng)期較長，直至培養(yǎng)進行到第9 d 時，菌絲干質(zhì)量達到所測數(shù)值最高點。其中第10 d 到第12 d 的菌絲干質(zhì)量差別不大，三角瓶發(fā)酵液中菌絲體干質(zhì)量依次為4.27 g/L，4.30 g/L，4.37 g/L。一直到第13 d 天菌絲干質(zhì)量出現(xiàn)明顯的下降，為3.57g/L。依據(jù)白肉靈芝生長曲線可知，白肉靈芝作為工業(yè)化生產(chǎn)的液體菌種，培養(yǎng)7 d較為適宜，生產(chǎn)中如果需要菌絲體，需要培養(yǎng)10 d，而收獲發(fā)酵代謝產(chǎn)物，則需要至少11 d。

圖1 白靈芝菌絲體生長曲線

2.2 C源對白肉靈芝菌絲體生長的影響

從不同C 源對白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響（表1）可以直觀地發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝菌絲體對各類C源均能吸收利用，但對于多糖類的利用優(yōu)于雙糖及單糖。在本文選擇的C 源中，白肉靈芝菌絲體對可溶性淀粉的吸收利用率最高，白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量達4.90 g/L，其次是玉米粉，菌絲干質(zhì)量為4.82 g/L。在本文使用的C 源雙糖中，白肉靈芝菌絲體對蔗糖的利用效果最好，菌絲干質(zhì)量為2.70 g/L。實驗中選擇的2 種多糖對白肉靈芝菌絲干質(zhì)量的影響比其他碳源利用高。但是，從成本考慮，優(yōu)先選擇使用玉米粉作為實驗C源的來源。

表1 不同C源對白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響

2.3 N源對白肉靈芝菌絲體生長的影響

從N源對白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響（表2）可以看出，在供試的N 源中，白肉靈芝菌絲體對酵母膏吸收利用效果最好，菌絲體干質(zhì)量為10.29 g/L，然后是硝酸銨、牛肉膏，實驗中N 源蛋白胨的吸收利用效果最差，菌絲體干質(zhì)量僅為3.17 g/L。試驗結(jié)果分析表明，與其他氮源相比，酵母膏效果最好。但是考慮到價格，可選硝酸銨作為實驗氮源。

表2 不同N源對白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響

2.4 pH值對白肉靈芝菌絲體生長的影響

從圖2 可明顯觀察到，白肉靈芝菌絲體對酸堿度的適應(yīng)范疇較廣，pH 值為1～13 均能生長，但是在其他條件不變，調(diào)節(jié)pH 值培養(yǎng)6 d 后，不難發(fā)現(xiàn)pH 值為6 時菌絲干質(zhì)量最高，但由于發(fā)酵期間，代謝產(chǎn)物會使發(fā)酵液體pH 值降低，故應(yīng)調(diào)高液體培養(yǎng)基的pH值，因此應(yīng)該選擇pH=7作為白肉靈芝菌絲體發(fā)酵較適宜的pH值。

圖2 pH值對白肉靈芝菌絲體生長的影響

3 結(jié)論與討論

白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵在利用C 源、N 源的時候不僅要考慮到利用率的問題，還需要考慮成本問題，因此在選擇C 源、N 氮源的時候有限考慮成本較低，有助于大規(guī)模生產(chǎn)的品種；發(fā)酵期間代謝產(chǎn)物會使發(fā)酵液pH 值降低，因此應(yīng)調(diào)高初始液體培養(yǎng)基的pH 值，因此主要選取玉米粉作為C 源，硝酸銨作為N 源，pH=7 作為最優(yōu)條件。本實驗如果僅僅從單因素方面研究不同條件對白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵的影響，不很全面，還需進一步進行多因素實驗分析，使其為白肉靈芝菌絲體發(fā)酵產(chǎn)業(yè)提供實踐依據(jù)和試驗指導(dǎo)。