青稞HVUL1H 08544.2 基因特性分析及互作蛋白篩選

旺 姆，羊海珍

（省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室/ 西藏自治區農牧科學院農業研究所，西藏 拉薩 850032）

青稞（Hordeum vulgareL. var. nudum Hook. f）營養價值豐富，是青藏高原藏族人民的主要糧食，同時也是重要的畜牧飼料以及啤酒、保健食品的原材料［1］。青稞作為西藏種植面積最大、產量占全區糧食作物總產比重最高的農作物，在西藏的農業發展中一直占據舉足輕重的地位［2］。然而，青稞在生長過程中易遭受各種病原菌的侵染，導致產量和品質下降。其中由布氏白粉菌屬大麥專化型活體寄生菌（Blumeria graminis f.sp.hordei）引起的真菌病害，在西藏各個青稞種植區普遍發生，危害日趨嚴重［3-4］。

目前，西藏青稞白粉病的基礎研究薄弱，主要集中在抗病鑒定、防治技術研究等方面［5-7］，有關青稞白粉病抗病機制的研究報道較少。發掘抗白粉病基因，解析青稞白粉病抗性機制，可以為青稞抗病育種提供指導，對防治青稞白粉病、保障青稞糧食安全具有重要意義。試驗前期進行了青稞應答白粉菌侵染的轉錄組學研究［8］，從分析結果中篩選到一個受白粉菌誘導后表達量顯著上調的基因HVUL1H08544.2，推測該基因在青稞抵御白受粉病侵染的過程中可能扮演著重要作用。本研究以HVUL1H08544.2為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術在青稞白粉菌誘導的cDNA 文庫中篩選互作蛋白，為進一步揭示HVUL1H08544.2 應答白粉菌侵染的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

青稞品種“藏青13”、青稞白粉菌誘導酵母雙雜交cDNA 文庫、大腸桿菌DH5α 菌株均由本實驗室保存；pGBKT7 載體、pGADT7 載體、SD 營養缺陷型培養基、YPDA 培養基、限制性內切酶、高保真擴增酶均購自大連寶生物工程有限公司；Y2HGold 酵母感受態細胞購自于上海唯地生物技術有限公司；RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA 純化試劑盒、質粒提取試劑盒購于無錫百泰克生物技術有限公司；一步法克隆試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司；其余常規生化試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 HVUL1H08544.2基因的克隆及序列分析

采集生長10 d的青稞葉片樣品，參照試劑盒說明書，提取青稞總RNA，反轉錄為cDNA。根據HVUL1H08544.2 基因的序列和pGBKT7 載體圖譜，設計并合成帶有載體同源系列的基因特異性引物HVUL1H08544.2-F （5’ -GCCATGGAGGCCGAATTCATGGAGTCCGACATGGACATG-3’） 和HVUL1H08544.2-R （5’ -CTGCAGGTCGACGGATCCTCAGTGGGCTTCTTCTCGCAT-3’）；以青稞葉片的cDNA 為模板，使用高保真酶進行PCR 擴增，將有目的條帶的PCR產物回收純化后送上海生工生物工程公司測序。所獲基因序列利用Expasy（https：//web. expasy. org/cgi-bin/protparam/）分析 蛋白質序列的分子量和等電點；用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白的結構域；利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST工具進行同源基因序列比對。

1.3 誘餌載體構建

參照一步法克隆試劑盒說明書，將測序驗證正確的目標片段連接到經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切的pGBKT7 載體上，采用熱激法轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，涂布于含卡那霉素的LB 平板上，37 ℃過夜培養。挑取單菌落，使用pGBKT7 載體 的 通用引物BD-F（5’- CGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGT-3’） 和 BD-R （5’ -CCGGAATTAGCTTGGCTGCAA-3’）進行PCR 檢測，將檢測獲得的陽性克隆進行擴大培養后提取質粒，送公司測序確認。

1.4 誘餌載體自激活活性檢測

參照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System 操作手冊，采用聚乙二醇/醋酸鋰的方法，將重組誘餌載體pGBKT7-HVUL1H08544.2 和pGADT7空載體共轉入Y2HGold酵母感受態中，轉化液稀釋10 倍后涂布于SD/-Trp-Leu 和SD/-Trp-Leu-His-Ade營養缺陷型固體培養基上，30 ℃倒置培養3～5 d，觀察其生長情況。

1.5 誘餌蛋白與青稞cDNA文庫雜交

將重組誘餌載體pGBKT7-HVUL1H08544.2 轉入Y2HGold 酵母感受態中，在SD-Trp 平板上培養3 d。挑取單菌落接種于50 mL SD-Trp 液體培養基中，30 ℃，220 rpm 培養至OD600為0.8 后離心，用5 mL SD/-Trp 重懸沉淀并轉移至2 L 錐形瓶中，加入2 mL 青稞白粉菌誘導的cDNA 文庫菌液（Y187）和45 mL 2×YPDA 液體培養基，30 ℃，40 rpm 培養20～24 h，取1滴菌液于顯微鏡下觀察是否出現酵母合子細胞；離心收集菌體，用50 mL 0.5×YPDA 液體培養基重懸后離心，棄上清液，用10 mL 0.9% NaCl溶液重懸菌液，分別涂布300 μL 至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養基平板上，30 ℃培養3～5 d，挑取酵母單克隆轉到另一個SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養基上復篩，重復3次，得到候選克隆子。

1.6 陽性克隆鑒定及分析

使用pGADT7 載體通用引物AD-F（5’-GGAGTACCCATACGACGTACC-3’）和AD-R（5’-TATCTACGATTCATCTGCAGC-3’）對3 次轉板后仍能正常生長的酵母單克隆進行PCR 檢測，回收PCR 擴增條帶后送公司測序。將測序所得序列比對到青稞基因組數據庫，得到與HVUL1H08544.2相互作用的蛋白，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org）對互作蛋白進行gene ontology（GO）注釋。

2 結果與分析

2.1 HVUL1H08544.2基因的克隆及特性分析

以青稞葉片的cDNA 為模板，PCR 擴增到上下游分別帶有17 bp 和18 bp 載體同源序列的目的片段（711 bp），條帶大小約750 bp（圖1），符合預期大小。通過Expasy分析可知，HVUL1H08544.2編碼的蛋白包含236個氨基酸，相對分子量為58.26 kD，理論等電點為5.08。 結構域分析顯示，HVUL1H08544.2 包含一個保守的HLH 結構域，位于67 和116 氨基酸之間，屬于bHLH 轉錄因子家族成員。BLAST 結果表明，在其他物種中，山羊草（Aegilops tauschii）中 的bHLH35-like 基 因 與HVUL1H08544.2系列一致性最高，為88.24%。

圖1 HVUL1H08544.2基因的電泳檢測

已有研究表明，bHLH 轉錄因子不僅能調控植物的生長發育、信號轉導及合成代謝等，而且參與了植物低溫、干旱、高鹽、缺鐵等逆境脅迫響應過程［9］。近年來陸續有研究表明，bHLH 轉錄因子在植物應答病原菌侵染的過程中也發揮了重要作用［10-11］。本研究中，受白粉菌誘導后上調表達的HVUL1H08544.2 屬于bHLH 轉錄因子，與上述研究結果相符。

2.2 誘餌載體的構建和自激活活性檢測

將HVUL1H08544.2 基因片段與pGBKT7 載體進行同源重組后轉化大腸桿菌，隨機挑取6 個單菌落進行PCR 鑒定，發現所有菌落均有目的條帶（圖2）。經過比對，質粒測序結果與HVUL1H08544.2序列完全一致，表明重組誘餌載體pGBKT7-HVUL1H08544.2 構建成功。將誘餌載體pGBKT7-HVUL1H08544.2 與pGADT7 空載體共轉化酵母Y2HGlod，在SD/-Trp-Leu 培養基平板上有正常的菌落生長（圖3A），說明pGBKT7-HVUL1H08544.2能夠在酵母中成功表達；在SD/-Trp-Leu-His-Ade培養基平板上沒有菌落生長（圖3B），說明誘餌載體不能啟動下游報告基因His，Ade 的表達，沒有轉錄自激活活性。

圖2 重組誘餌載體pBGKT7-HVUL1H08544.2的PCR鑒定

圖3 共轉化pGBKT7-HVUL1H08544.2與pGADT7的菌株在缺陷培養基上的生長情況

2.3 HVUL1H08544.2互作蛋白的篩選

將含有pGBKT7-HVUL1H08544.2 誘餌載體的Y2HGold 菌株與含有青稞cDNA 文庫的Y187 菌株共培養，22 h后鏡檢可觀察到三葉草型的酵母合子細胞（圖4），表明誘餌菌株與文庫菌株形成了結合子，雜交成功。經過SD/-Trp-Leu-His-Ade 缺陷培養基的3次篩選，共獲得32個候選單克隆。PCR 鑒定結果顯示能擴增出條帶的單克隆有26 個，片段大小在500 bp和2000 bp 之間（圖5）。將PCR條帶測序結果在青稞基因組數據庫中進行比對，去除重復克隆，排除沒有完整開放閱讀框的蛋白后，進行GO 注釋，最終得到5 個與pGBKT7-HVUL1H08544.2 相互作用的蛋白（表1），分析發現它們參與了光合作用、防御反應、激素應答等多個生物過程。

圖4 酵母合子細胞觀察

圖5 酵母陽性克隆的PCR鑒定

表1 HVUL1H08544.2互作蛋白信息

3 結論與討論

已有研究表明，bHLH 轉錄因子可通過特定的結構域與靶基因相互識別并作用，激活或抑制相關基因的表達，進而調控植物的生長發育、信號轉導、逆境脅迫響應等過程［12］。目前，該轉錄因子家族在植物抗病中的研究相對滯后，其蛋白互作網絡也鮮見報道。本研究中以課題組前期從青稞中鑒定的一個受白粉菌誘導上調表達的bHLH 轉錄因子——HVUL1H08544.2 為誘餌，篩選出了5 個與其相互作用的蛋白，它們參與了植物光合作用、防御反應、激素應答等生物過程。 由此，推測HVUL1H08544.2 通過參與以上生物過程來調節青稞對白粉病的抗性，但要明確具體機制，后續還需進行大量的研究。

值得一提的是，酵母雙雜交系統雖然靈敏性高、操作方便，但由于一些蛋白質不需要“誘餌”與“獵物”的特異性結合便能激活酵母內報告基因的表達，會導致結果產生假陽性［13］。因此，需要通過雙分子熒光互補、免疫共沉淀等其他方法進一步對互作進行驗證。