大孔樹脂-無(wú)機(jī)陶瓷膜聯(lián)用技術(shù)對(duì)消腫止痛液鹽酸小檗堿含量的影響

宮凱敏， 白云鳳， 董亞楠， 劉 軍

（銀川市中醫(yī)醫(yī)院，銀川 750001）

消腫止痛液（寧藥制字Z20140005）處方由地榆、黃柏、五倍子等八味中藥組成，臨床用于治療各種原因所致的外痔、內(nèi)痔及混合痔，療效確切，深受患者好評(píng)[1]。該方由黃柏、芒硝、益母草、乳香、沒(méi)藥、五倍子組成。原劑型為洗劑，純化工藝較為簡(jiǎn)單，僅采用高速離心法處理。后期應(yīng)用于市場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)，作為復(fù)方制劑由于體系中成分復(fù)雜，存儲(chǔ)過(guò)程中易于沉淀、穩(wěn)定性差，同時(shí)洗液存在有效濃度低、使用劑量大且有效成分不易長(zhǎng)期吸附于病灶部位，劑型及純化工藝限制了品種的發(fā)展。課題組擬將洗液進(jìn)行劑型改革開(kāi)發(fā)為軟膏劑[2]，通過(guò)純化工藝以增加新劑型載藥量。通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知，大孔樹脂純化技術(shù)與無(wú)機(jī)陶瓷膜分離技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于中藥提取液除雜工藝當(dāng)中，考慮到二者適用性不同，將二者聯(lián)用發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)的同時(shí)能夠極大彌補(bǔ)各自的劣勢(shì)，故本文對(duì)聯(lián)用工藝進(jìn)行優(yōu)選，考慮黃柏為該制劑的君藥，所含鹽酸小檗堿為其主要活性成分，且通過(guò)前期藥理試驗(yàn)顯示，相同濃度劑量下消腫止痛液與不含黃柏的陰性制劑在大鼠痔瘡療效評(píng)價(jià)中有差異，故以黃柏指標(biāo)性成分鹽酸小檗堿含量變化作為聯(lián)用技術(shù)篩選的依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260 系列高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫），電子天平（METTLER TOLEDO XS205）；KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分子之一電子天平（梅特勒XS205）；無(wú)機(jī)陶瓷膜設(shè)備（江蘇久吾，膜材料Al2O3，孔徑分別為800 nm、500 nm、150 nm，膜面積 0.5 m2）。

1.2 試劑和藥物

鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)：110713-201212）；AB-8、HPD600、D101型大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；消腫止痛液（銀川市中醫(yī)醫(yī)院制劑，批號(hào)20180301）；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，色譜柱：DiamonsilTM（鉆石）C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；乙腈∶0.1%磷酸（48∶52）（每 100 mL 加十二烷基磺酸鈉 0.1 g），檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm，流速 1.0 mL·min-1，柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取消腫止痛液5 mL 置50 mL 量瓶中，加入流動(dòng)相35 mL，超聲處理15 min，放至室溫，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 取消腫止痛液處方中除去黃柏以外的其余藥材，按照消腫止痛液處方量、配制工藝及供試品溶液制備方法，制得陰性供試品。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性制品溶液各10 μL，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，陰性供試品溶液中其他色譜峰對(duì)鹽酸小檗堿測(cè)定無(wú)干擾，表明專屬性良好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 消腫止痛液專屬性考察色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取上述對(duì)照品溶液 2、4、8、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以鹽酸小檗堿進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y＝187.6X-3.658（r2＝0.9997）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在0.548～5.48 μg 范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿（n=6）為0.98%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿RSD（n=6）為1.97%，表明供試品溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液6 份，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果顯示鹽酸小檗堿峰面積（n=6）RSD 為2.74%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的消腫止痛液10 mL，共6 份，分別精密加入鹽酸小檗堿已知含量的0.8倍、1.0 倍、1.2 倍各 2 份，按供試品溶液方法制備樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算平均加樣回收率為98.01%，RSD=2.66%。

2.9 大孔樹脂吸附實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

2.9.1 大孔樹脂型號(hào)的篩選 取已處理的3 種型號(hào)樹脂，其中AB-8 弱極性樹脂、HPD600 極性樹脂、D101 非極性樹脂各10 g，放置于100 mL錐形瓶中，加入消腫止痛液1 mL，其中鹽酸小檗堿含量為 4.524 mg·mL-1，計(jì)算各樹脂 30 min、60 min、120 min 的鹽酸小檗堿吸附量、總吸附量及吸附率，結(jié)果見(jiàn)表1。

基于上述優(yōu)勢(shì)，上海自貿(mào)試驗(yàn)區(qū)的定位是繼續(xù)創(chuàng)新體制機(jī)制，探索契合中國(guó)與新興經(jīng)濟(jì)體和轉(zhuǎn)軌國(guó)家的合作機(jī)制和模式，建設(shè)服務(wù)“一帶一路”市場(chǎng)要素資源配置新樞紐；將金融創(chuàng)新和科技創(chuàng)新作為上海自貿(mào)試驗(yàn)區(qū)的重中之重，開(kāi)展與沿線國(guó)家和地區(qū)在金融資源和要素的跨境流動(dòng)、離岸研發(fā)、海洋經(jīng)濟(jì)、數(shù)字信息與安全等領(lǐng)域的合作，將上海自貿(mào)試驗(yàn)區(qū)打造成為“一帶一路”開(kāi)放合作新平臺(tái)；利用居于國(guó)際產(chǎn)業(yè)鏈和價(jià)值鏈中高端位置的產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)和制度優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)國(guó)際產(chǎn)能合作和境外經(jīng)貿(mào)合作園區(qū)建設(shè)，搭建“引進(jìn)來(lái)”和“走出去”有機(jī)結(jié)合的新載體。

將上述3 種靜態(tài)吸附后樹脂過(guò)濾，濾紙吸干，以不同濃度乙醇各10 mL 依次洗脫，收集各洗脫液，過(guò)濾，加入流動(dòng)性定容至10 mL，微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣，測(cè)定各樣品中鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表1 靜態(tài)吸附結(jié)果顯示樹脂AB-8 與D-101 對(duì)消腫止痛液中鹽酸小檗堿有較強(qiáng)的親和力。表2 結(jié)果顯示相同洗脫溶劑條件下AB-8樹脂解吸附效果最好，故選擇AB-8 應(yīng)用于消腫止痛液大孔樹脂除雜工藝。

表1 3 種樹脂對(duì)消腫止痛液鹽酸小檗堿的靜態(tài)吸附數(shù)值表

表2 3 種樹脂對(duì)消腫止痛液鹽酸小檗堿的靜態(tài)洗脫值表

2.9.2 工藝參數(shù)考察與優(yōu)化

（1）大孔樹脂純化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)靜態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)，優(yōu)選AB-8 樹脂進(jìn)行試驗(yàn)，以上樣液濃度［A，（g·mL-1）］、大孔樹脂用量：上樣量（B）、乙醇洗脫劑濃度（C，%）及洗脫劑：上樣量（D）為考察因素，以洗脫液中鹽酸小檗堿回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行4 因數(shù)3 水平正交試驗(yàn)，見(jiàn)表3、表 4。

表3 大孔樹脂純化因素水平表

結(jié)果表明，以鹽酸小檗堿回收率作為考察指標(biāo)，洗脫劑乙醇濃度對(duì)其回收率有影響，從表4中 可知：A2＞A1＞A3，B3＞B1＞B2，C3＞C2＞C1，D2＞D3＞D1，故最佳大孔樹脂除雜工藝應(yīng)為A2B3C3D2，即大孔樹脂純化最佳工藝為：藥液質(zhì)量濃度為1.0 g·mL-1，大孔樹脂用量（g）與上樣量（mL）比為 8∶1，60%乙醇濃度，洗脫劑（mL）與上樣量（mL）比為 8∶1。

表4 大孔樹脂純化正交試驗(yàn)結(jié)果

（2）大孔樹脂最佳純化工藝驗(yàn)證。采用上述最佳工藝條件，連續(xù)大孔樹脂純化3 批次樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果鹽酸小檗堿平均透過(guò)率92.12%，RSD 為1.89%，驗(yàn)證該工藝可行性。

2.10 無(wú)機(jī)陶瓷膜濾過(guò)試驗(yàn)

膜分離技術(shù)作為近年來(lái)中藥提取分離的一項(xiàng)技術(shù)，原理為以物理“篩分”效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)不同分子量物質(zhì)之間的分離，有研究報(bào)道對(duì)比過(guò)膜前后兩種藥液的理化性質(zhì)，除濁度和外觀有明顯變化之外，其他理化性質(zhì)基本保持相同，鑒于膜分離技術(shù)具有精制效率高、無(wú)污染及節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)[3-6]，目前廣泛應(yīng)用于中藥制劑澄清工藝研究。

2.10.1 過(guò)膜前藥液配制 收集經(jīng)AB-8 樹脂純化后的藥液減壓回收乙醇濃縮至0.5 g·mL-1生藥量，測(cè)定其中鹽酸小檗堿含量，用純化水進(jìn)行稀釋，制備無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾中不同濃度的實(shí)驗(yàn)用樣品溶液。

2.10.2 無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾正交方案設(shè)計(jì) 影響無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾效果主要為操作壓力即壓差、藥液濃度、過(guò)膜溫度與膜孔徑4 個(gè)因素，實(shí)驗(yàn)以壓差（E，MPa）、藥液濃度［F，（g·mL-1）］、過(guò)膜溫度（G，℃）、膜孔徑（H，nm）為考察因素，進(jìn)行 4 因素3 水平正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表5。

表5 無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾因素水平表

2.10.3 消腫止痛液無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾試驗(yàn)優(yōu)選 無(wú)機(jī)陶瓷膜用純化水處理，排盡體系中清洗液，分別取上述濃度的藥液各20 L，泵入無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾系統(tǒng)中進(jìn)行平衡約30 min，開(kāi)始過(guò)濾，收集過(guò)濾液；各操作條件下制備濾液中鹽酸小檗堿的透過(guò)率見(jiàn)表 6。

表6、表7 結(jié)果顯示，消腫止痛液經(jīng)大孔樹脂純化后經(jīng)無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾，方中指標(biāo)性成分鹽酸小檗堿透過(guò)率最低為79.42%，最高為91.23%，鹽酸小檗堿整體透過(guò)率較高，證明適用于無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾。對(duì)表6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明：各因素的影響次序?yàn)镕>H>E>G，因素F、H 均對(duì)鹽酸小檗堿透過(guò)率有影響（P<0.05），其他因素對(duì)結(jié)果無(wú)影響（P>0.05）；確定最佳無(wú)機(jī)陶瓷膜超濾工藝為 E2F1G2H3，即操作壓力 0.2 MPa，藥液濃度0.1 g·mL-1，過(guò)膜溫度 40 ℃，膜孔徑 800 nm。

表6 鹽酸小檗堿L9（34）透過(guò)率正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

2.10.4 無(wú)機(jī)陶瓷膜最佳過(guò)濾工藝驗(yàn)證 采用上述最佳工藝條件，連續(xù)無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾3 批次樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果鹽酸小檗堿平均透過(guò)率93.68%，RSD 為1.43%，驗(yàn)證該工藝可行性。

3 討論

課題前期分別采用水提醇沉法、大孔樹脂吸附法及無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾法進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：水提醇沉工藝指標(biāo)性成分鹽酸小檗堿回收率低且浸膏得率高，大孔樹脂吸附法鹽酸小檗堿回收率高但浸膏得率較高，無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾法鹽酸小檗堿回收率高且浸膏得率低，同時(shí)膜分離有著無(wú)需加熱、操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[7]，但由于藥液未進(jìn)行預(yù)純化，極容易導(dǎo)致膜堵塞污染，膜通量急劇下降。大孔吸附樹脂具有選擇性好，吸附速度快，分離處理量大，可再生重復(fù)使用節(jié)約成本等特點(diǎn)，大孔樹脂近年來(lái)也逐步應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的工藝純化處理[8-10]。綜合考慮，選用大孔樹脂吸附聯(lián)用無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾進(jìn)行消腫止痛液純化，在此工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行軟膏劑開(kāi)發(fā)。

消腫止痛液作為中藥復(fù)方制劑，療效為多種成分協(xié)同作用的結(jié)果。本文選用消腫止痛液君藥黃柏藥效成分鹽酸小檗堿作為大孔樹脂純化回收率及無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾透過(guò)率效果評(píng)價(jià)指標(biāo)性成分，合理可行。處方中剩余藥味藥效成分大孔樹脂純化及無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾適用性研究及對(duì)純化工藝制備的制劑與原制劑進(jìn)行等效性評(píng)價(jià)，將在后續(xù)項(xiàng)目中繼續(xù)進(jìn)行。目前大孔樹脂與膜分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于中藥液體制純化，藥液pH 均對(duì)兩種技術(shù)純化效果有一定影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)予以考慮。

本文充分發(fā)揮兩種技術(shù)各自優(yōu)勢(shì)，將大孔樹脂吸附與無(wú)機(jī)陶瓷膜過(guò)濾聯(lián)用應(yīng)用，在確保藥效的基礎(chǔ)上去除了體系中絕大部分雜質(zhì)，提高制劑穩(wěn)定性，增加了有效濃度，為開(kāi)發(fā)新劑型打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑純化工藝提供了新的思路和方法。