單胚胎移植策略中胚胎發育潛能的評估方法

劉 芳， 于辛酉， 包俊華， 金 銳， 唐大偉， 白 剛

（1.銀川市婦幼保健院生殖醫學中心，銀川 750001； 2.寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，銀川 750004）

目前全世界有700 多萬兒童是通過輔助生殖技術出生的。輔助生殖的最終目的是在保護母體安全的同時獲得足月健康的嬰兒。多胎妊娠有較高的早產風險和更高的并發癥發生率，這是在輔助生殖技術應用中一直存在的一個主要障礙。提高妊娠率的同時降低多胎妊娠的風險，是當前輔助生殖需要重點攻克的方向。單胚胎移植在保證妊娠率的同時，可降低多胎妊娠、早產、低出生體質量以及剖宮產的發生率。評估胚胎發育的質量和潛能是提高臨床妊娠率的關鍵步驟之一，是從實驗室走向臨床的首要指標，也是預測妊娠結局的有力證據。因此，避免多胚胎移植并選擇高質量的單胚胎進行移植，在近些年也得到更廣泛的認可和發展。

選擇移植最有發育潛能的胚胎在輔助生殖過程中是非常重要的，而如何能夠安全無創、快捷有效地選擇出最適合的胚胎，已成為當前胚胎移植研究的熱點。目前臨床上已經有許多質量評價方法，包括傳統的形態學和近幾年發展的代謝組學、延時監測技術和基因組學等評價方法，現對近期各種研究結果綜述如下。

1 代謝組學方法

代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學和轉錄組學之后發展起來的一門學科，它很好地反映了基因表達下游的事件，并提供了有關細胞內代謝有價值的信息，這是其他組學技術無法做到的。它能反映機體的動態代謝狀態，因此可以檢測疾病與藥物作用的相關性。代謝組學大概能測定3000 種代謝物，數據量遠小于蛋白組和轉錄組，相對而言分析可以更快[1]。目前常用的分析技術包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、拉曼光譜（Raman）、近紅外光譜（near infrared，NIR）、質譜（mass spectrometry，MS）、色譜（chromatography）和色譜—質譜聯用技術[2-3]，它們在測定不同代謝物上各有優勢。由于代謝物種類繁多，各物質之間差異比較大，且濃度分布范圍廣，僅靠一種分析技術無法完成。目前已知總體質量差的胚胎移植與單胎出生體質量的降低有關，而評估胚胎總體質量需要全面測定胚胎的各種代謝物[4]。因此，臨床上常聯合使用幾種分析技術對代謝產物進行全面分析[5]。預測胚胎發育潛能相關，且研究較多的代謝產物，主要源于以下幾個微環境。

1.1 卵泡液

卵泡液是指發育中卵母細胞的體內微環境，包含對卵泡生長和卵母細胞成熟至關重要的所有成分以及卵母細胞排出的代謝物。卵泡液的代謝組成一定程度上反映了卵母細胞的質量[6]。Pi?ero-Sagredo 等[7]首次利用 NMR 研究人體卵泡液，鑒定出一些能作為卵泡成熟狀態的生物標記物的代謝物，選擇出具有更高受精潛能的卵母細胞，提高體外受精（in vitro fertilization，IVF）的成功率。McRae 等[8]利用NMR 技術對10 名接受自然周期IVF 女性中的卵泡液進行分析，發現排卵期的卵泡液為高水平的乳酸、丙酮酸和低水平的葡萄糖。有研究[9]通過氣相色譜/質譜（GC/MS）的代謝組學方法，比較IVF 成功和IVF 重復失敗（RIF）患者卵泡液的代謝物，發現RIF 卵泡液組幾種氨基酸（纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和鳥氨酸）水平升高，二羧酸、膽固醇和一些有機酸水平降低。但卵泡液作為輔助生殖的生物標記物，目前仍有明顯的局限性。比如，卵巢刺激過程或沖洗介質都可以改變卵泡液的成分[10]。由此可見，關于卵泡液的代謝組學分析的研究還處于起步階段，要實現卵泡液的整體代謝組學圖譜的臨床應用還需要更多的研究。

1.2 胚胎培養基

如今在臨床實踐中，快速經濟的胚胎質量評估方法仍是形態學評估和卵裂率。胚胎質量的生物標記可以克服形態學評估的一些弱點。胚胎培養基（embryo culture medium，ECM）的研究表明，胚胎之間的代謝差異可能表明了受精成功的潛力，但其在臨床應用方面的意義仍有待商榷[11]。Vergouw 等[12]使用近紅外光譜（NIR）對培養基進行代謝組學分析，選擇第3 天的胚胎，與僅通過形態學選擇胚胎相比，試管嬰兒的活產率無差異。Hardarson 等[13]的研究表明，在胚胎形態中加入ECM 的近紅外光譜并不能提高單胚胎移植（SET）后第2 天和第 5 天的妊娠率。Sfontouris等[14]研究發現基于NIR 儀器進行的ECM 代謝組學分析對第2、3 和5 天的妊娠率和活產率均無有利影響。以上研究表明，與僅使用形態學相比，將ECM 代謝組學分析加入形態學并不能提高獲得可行妊娠的概率。

1.3 子宮內膜

人類子宮內膜是一個動態組織，在自然月經周期的短時間內接受著床，稱為“著床窗口”。這個窗口隨著月經周期的長短而變化，與正常周期19～21 d 一致。在同一周期內抽吸子宮內膜液可以不影響著床或妊娠率，這意味著子宮內膜的代謝組學分析可以與胚胎移植在同一周期內進行[15-16]。識別與子宮內膜容受性相關的生物標記物在臨床上是可取的，可影響輔助生殖治療患者的妊娠率。

2 延時監測系統

延時監測技術是一種對輔助生殖過程中胚胎形態和發育動力學進行半定量評價的新技術，是否具有臨床應用價值尚無定論[17-18]。傳統上，胚胎評估是指將胚胎從常規培養箱中取出，每天在光鏡下鏡檢來進行評估。延時系統是指頻繁地拍攝胚胎的數字圖像，將延時記錄技術與臨床實踐相結合，使胚胎學家在不干擾胚胎培養的同時，對胚胎發育有更深入的了解。使用帶有形態動力學算法的延時攝影系統可以顯著改善妊娠和活產率，并減少早期妊娠損失[19]。Rubio 等[20]研究發現，在綜合胚胎鏡延時監測系統中培養和選擇胚胎的方法改善了生殖結果。延時監測系統組的持續妊娠率增加至51.4%，標準組的持續妊娠率為41.7%。Adamson 等[21]對基于 TLM 系統的第 3 天胚胎移植研究發現，與僅基于形態學分析比較，試驗組的胚胎移植率和臨床妊娠率高于對照組。除了鑒定具有高植入潛能的胚胎外，延時分析還揭示了常規靜態形態學評估所遺漏的異常事件。多核、直接卵裂（1～3 個細胞直接分裂）和反向卵裂等特異事件均被發現與植入電位降低有關[22-25]。而在 Goodman 等[18]的研究中，添加延時形態動力學數據并未改善臨床生殖結果，臨床妊娠率和著床率總體上與囊胚轉移相似。因此，延時診斷系統提供了有關胚胎質量的寶貴信息，可幫助臨床醫生選擇胚胎進行單胚胎移植。延時監測技術中，標準化的觀測時間還沒有一個確切點，但這一點在臨床上是至關重要的。因此也需要更多的科研數據進一步確定這一觀測時間點，以方便延時檢測技術在臨床上更廣泛地使用。

3 胚胎植入前遺傳篩查

遺傳信息的載體——染色體是影響胚胎發育潛能的重要因素，年齡超過40 歲的女性的染色體異常率≥50%。染色體異常對胚胎發育或胎兒發育有致死效應，因此在輔助生殖過程中，染色體篩查可提高染色體異常患者的臨床妊娠率和降低自然流產率，尤其適用于高齡產婦。目前染色體篩查的主要方法是植入前非整倍體遺傳檢測（PGT-A），也稱為 PGS[26]。PGS 通過分析全部24 條染色體的拷貝數，以篩查胚胎非整倍性改變。Forman 等[27]納入了 175 名年齡≤42 歲的體外受精夫婦，一組接受單整倍體胚胎移植，另一組接受未活檢的雙胚胎移植。結果顯示，前者的多胞胎接生率遠低于后者。通過對35 歲及以上的婦女使用 PGS，多胎妊娠率明顯降低[28]。Kang 等[29]研究發現，在年齡≤37 歲的女性中，IVF-PGS 對活產率和流產率無影響；但在年齡＞37 歲的女性中，IVFPGS 確實改善了臨床妊娠率和活產率。但另有研究[26]顯示，PGS 第3 天活檢對胚胎有侵襲性，可能會導致胚胎嵌合，而這種胚胎嵌合現象會嚴重干擾PGS 的結果解讀。新一代測序（NGS）正在取代最初PGS 中的熒光原位雜交技術（FISH），減少對胚胎的侵襲性，且具有精度高、成本低的優點，但仍會導致胚胎嵌合。因此，PGS 作為體外受精患者篩選技術的價值還有待確定[30]。

越來越多的輔助生殖接受者在臨床咨詢后，患者對懷孕可能性的重視程度降低，而對孕產婦和圍產期風險的重視程度增高。在咨詢之后，大量的接受者會選擇單胚胎移植[31]。對胚胎質量進行科學的評估是保證妊娠率的一個重要方法。傳統的形態學和近幾年發展的代謝組學、延時監測技術和基因組學等評價方法，在臨床應用上各有優勢。這可能與胚胎的發育潛能受多種因素影響、不同年齡的婦女卵母細胞質量不同等有關，最終導致各種檢測方法得到的結論不一致。故單一的形態學指標不足以預測胚胎的最終結局，需要從更多維度和更多水平來綜合評價。因此，在保證無創準確、高效快速的基礎上，合理利用篩選方法十分重要。此外，還需要更多的臨床研究結果，讓患者、醫生和衛生保健工作人員相信，即使單胚胎移植可能稍微延長了受孕的時間，選擇性單胚胎移植對母體和胎兒總體影響要優于多胚胎移植。