快速測定片在微生物檢測中的應用

于金巖 張玲玲

青島雙鯨藥業股份有限公司 山東青島 266000

快速測試片是一種預先制備好的一次性培養基制品，含有微生物生長所需營養物質及顯色劑，具有操作簡便、便于運輸、成本低等優點。

1 微生物檢驗的內容及特點

我國微生物檢驗主要內容包括：菌落總數、大腸菌群、致病菌、霉菌及其毒素等微生物指標。菌落總數、大腸菌群數是衡量衛生學指標是否合格的重要指標。致病菌主要包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌等。近年來，《國家安全監督抽檢實施細則（2018-2021年版）》越來越重視微生物項目的檢測，幾乎所有的大類均需要檢測微生物。在一些種類中開展了特定的致病菌檢驗，包括包裝飲用水中新增了“銅綠假單胞菌”，預包裝熟肉制品中檢測“單核細胞增生李斯特氏菌”等。

微生物檢驗的主要具備的特點是及時性、準確性、廣泛性、干擾性。在原材料中存在的微生物種類豐富多樣，且會迅速繁殖，另外保質期有限，因此，對微生物的檢測需及時有效，確保檢測數據及結果的準確可靠；也可對多種微生物元素同時檢測，以節約檢測時間，提高檢測效率。這也體現了微生物檢測的廣泛性，不僅可以檢測出中添加的微生物，還可以檢測出各種致病微生物。另外，原料中污染途徑較多，對檢測工作存在一定的干擾[1]。

2 快速測定片在微生物檢測中的應用

2.1 將濾紙作為載體的測試片

在選擇測試微生物的濾紙時需嚴格檢查其質量，并保證選用的濾紙無毒、吸附性強、尺寸為4cm×5cm。隨后在無菌培養基中添加TTC，并運用無菌濾紙進行吸附，接著再對其進行干燥處理，在這些步驟完成后就可將其放入聚丙烯材質的袋子中保存。在無菌培養基中添加TTC的主要目的是運用其氧化還原特性，讓其與氫進行反應，當兩者發生反應后，培養基中能夠看到較為明顯的紅點，通過計算紅點，即可計算出細菌的數量。當然在采取這一方法對細菌進行檢測時需要科學合理控制TTC的使用，避免影響后續的檢測結果。專業人員在測試時，還需合理控制培養基的溫度，一般會控制在37℃左右，測試時間大約為17h。

2.2 立足于染色法的大腸菌群測試片

這一方法需要制作浸液，這就需要對乳化劑、瓊脂以及TTC等用料進行細致的把控，設置滅菌溫度115℃，浸泡溫度60℃、烘干溫度55℃，調整pH范圍為6.8-7.0，培養時間為17h。若培養基里出現紅色斑點，外周黃暈或紙片產生黃色背景，在黃色背景上出現紅色斑點或片狀黃暈者為陽性。不過需要注意的是，培養液中的選擇性以及生物酶作用中的特異性，都會直接影響到大腸菌群測試片的最后測驗結果。基于此，相關專業人員需要嚴格檢測TTC和瓊脂粉的用量[2]。

2.3 熒光法大腸桿菌測試片檢測微生物

細菌會產生一些代謝酶或產物，可以根據細菌的這一特性，建立酶-底物反應法。工作人員將即將進行檢測細菌所需的養料、酶促底物和抑制雜菌的成分固相化在紙片上，然后檢測大腸菌群與大腸桿菌所產生的有關酶的活性，進而達成細菌計數這一目的。現有的兩種測試片能夠對大腸菌群與大腸桿菌進行檢測，這兩種細菌都需在37℃的培養箱中培養，然后24h后使用波長為365nm的熒光燈進行檢測，得出具體結果。

2.4 以Petrifilm為基礎的測試片

Petrifilm測試片主要由上下兩層薄膜組建而成，下層薄膜的主要材質為聚乙烯，它上面有網格，覆蓋于培養基上，而上層則主要是聚丙烯薄膜。微生物生長和生化實驗需要的營養試劑，通過冷水可溶性凝膠劑附著在上下兩層薄膜上。Petrifilm測試片在國際上也得到了廣泛認可，我國也有400多個實驗室采用這一測試片檢測微生物，這一測試片的主要檢測對象為：大腸菌群、金黃色葡萄球菌。這一檢測方法效率較高，檢測數據準確性也較高，值得被信賴。

2.5 菌落總數測試片的使用

將1mL樣品滴入紙片中央，然后將原本翻開的膠片進行回蓋操作，從而保證樣品的均勻性。為了保證凝膠的固化作用，需要靜置1min，這一測試方法也需要在37℃的培養箱中培養，其培養時間大約為48h。

2.6 測試霉菌和酵母菌

檢測霉菌及酵母菌的含量主要運用到了營養物質和菌落生長指示劑等。對這類真菌的培養溫度需要保持在21-25℃，時間為3-5d。酵母菌菌落主要為小型菌落，且有著明顯的邊緣，菌落為灰白色到藍綠色，也會呈現出粉色，顏色較為一致，中心也沒有暗色表現。霉菌菌落較大，質地也較為疏松，外觀表現主要為干燥，不透明，還會呈現出一種或緊或松的狀態，顏色也較為雜亂，同時還具有扁平性特點[3]。

3 微生物檢驗質量控制

微生物檢測質量控制是生物實驗室檢測工作的重要環節，其在微生物檢測過程中至關重要。影響微生物檢測的質量控制要素較多，如實驗室質量管理體系、實驗室設計、檢測人員素質、實驗室環境、樣品采集與保存、檢測方法及檢測過程、儀器設備是否檢定、培養基及試劑耗材的有效性、標準菌株的合理管理等都是影響檢驗結果準確與否的直接因素。這些環節相互影響，保證每一個環節的質量，確保測量結果的準確可靠。

實驗室微生物檢測常規的質量控制方式有：開展空白對照、對培養基試劑及標準菌株的質控、開展盲樣考核、平行實驗、標準菌株陰陽性對照、留樣復測、人員比對、儀器比對、實驗時間比對等。實驗室每年應根據檢驗檢測工作量統計情況、人員情況、內部審核結果、儀器設備情況、環境狀況、檢驗檢測方法變更及查新、檢測報告出現的問題等方面，及時制定適合實驗室自身發展的質量管理計劃，組織管理人員開展實施計劃，并對質量控制結果進行評價。

3.1 實驗室質量管理體系的構建

微生物實驗室質量控制體系的規范運行，需要建立完整的實驗室質量管理體系制度，通過體系、制度科學的管理實驗室，所有工作均應有相應的程序文件、工作指導書支持，檢測人員的實驗操作應符合操作規范，有效提升實驗室檢驗水平和檢測結果的準確性。

3.2 對人員和環境的控制

微生物檢測人員應具備相關專業或者微生物學專業背景知識，應滿足國家對從事微生物檢驗檢測工作的任職要求，并應具備熟練的實際操作經驗。在開展微生物檢測工作時，檢測人員應具備良好的職業道德，具備耐心、細心和責任心，具備較強的綜合素質、技術能力，具備終身學習的理念。檢測人員開展實驗前應進行崗前培訓，并定期開展有關微生物檢測方法和生物安全方面的培訓活動，不斷提高自身專業素養，培養責任意識。檢測人員應多參加檢測技術交流會，掌握國內外先進的微生物檢驗技術研究進展，提高自身專業素質以及實驗室的檢測效率，進而更好地適應不斷更新的檢測要求。同時，檢驗人員需具備良好的個人衛生習慣，定期體檢。在微生物檢測質量控制過程中，對工作人員的技能水平不斷提升，同時引進先進的微生物檢測技術，使檢測人員掌握全新的微生物檢測技術，積累實驗能力及分析判斷能力，為檢測提供更好的服務。

檢測人員應嚴格按照微生物檢驗環境監測要求，對操作環境進行科學配置，制定完善的微生物室環境管理制度，定期檢查實驗所需要的溫濕度以及清潔度。實驗室各間的規劃須符合相關標準的要求，遵循單項檢測流程原則，避免檢測結果交叉污染而產生誤差。針對無菌操作區域，實驗前必須經紫外線消毒30min后進行檢測工作。檢測工作結束后，及時做好消殺工作，妥善處理檢驗后的樣品及廢棄物。定期開展紫外燈期間核查工作，確保微生物檢驗樣品不受環境的影響，保持實驗室環境整潔。

3.3 對儀器設備及試劑耗材的控制

檢測人員應定期核查高壓滅菌器的壓力表、培養箱的溫度、冰箱的溫度、環境的溫濕度、紫外線的消毒能力等。在檢測過程中，必須具備完備的檢測設備，并且正確的使用相關設備。按照檢測機構《程序文件》的相關要求，定期清潔儀器設備，做好儀器設備的檢定、校準、維護保養及期間核查工作。定期更換檢測儀器和設備，淘汰廢舊設備，確保實驗數據的準確性。對檢測儀器進行定期維護保養，運用先進的監控技術對微生物檢測儀器進行全方位監控，保證儀器的穩定性，使微生物檢測質量得到保證。檢測設備的不穩定直接導致檢測人員分析和判斷出現偏差或錯誤，影響檢測結果。

培養基與試劑耗材對微生物培養的成敗及樣品的合格率構成決定性影響。同時，要保證培養基與試劑處于有效期內，并將培養基與試劑存儲于滿足要求的環境內，以便為檢測效果提供保障。定期開展培養基與試劑的技術性驗收，做好一次性耗材的驗收工作。配置培養基時，按照說明指導的要求規范操作，及時滅菌處理。定期核查培養基的有效期及性能測試。

3.4 對方法的選擇和檢測過程的控制

我國與微生物檢測有關的標準主要包括國家標準、地方標準、企業標準及行業標準。在開展檢測工作時，應選擇現行有效的檢測標準為依據開展實驗。若可供選擇的檢測方法有多種，需以產品明示的檢測標準或客戶要求的標準為主；當標準方法或權威機構發布的檢驗檢測方法均無法滿足檢測要求時，則使用其他非標準方法，如超出其預定范圍使用的標準方法、實驗室自制方法、修改過的標準方法等。實驗室在采用相關檢測方法進行檢測工作前，應對該方法進行驗證，必要時進行方法的確認[4]。

在開展微生物檢測工作過程中，應嚴格按照我國微生物檢驗系列標準開展業務。按照標準規定的相關要求開展實驗操作，合理進行數據處理。微生物檢測包含了樣品采集、樣品運輸、樣品核對以及保存、樣品檢測及培養、結果分析、數據處理、報告生成等流程。在開展樣本測試時，應嚴格按照相關標準進行樣本處理。配制試劑時，嚴格按照技術標準配制，采用高壓濕熱滅菌法對培養基進行高溫滅菌。實驗前對無菌室進行紫外消毒，沉降菌檢測工作，檢測人員做好自身防護，實驗過程中注意規范操作，避免交叉污染，做好空白對照、陰陽性對照，必要時使用標準菌株對樣品的陰性、陽性結果進行對照分析，確保檢測結果的準確可靠。實驗室監督員應對檢測人員做好監督，發現問題及時整改。檢測結束后，需妥善處理垃圾等廢棄物。另外，需加強檢測方法及技術的研發及創新工作，低成本、高效率、易操作、高準確性等優勢的檢測技術是未來的研究方向。

3.5 對樣品采集和保存樣品的控制

樣品采集是微生物檢驗過程中的關鍵環節，不同的樣品有不同的采集和保存方法，采樣不規范或樣品保存不當均會影響檢測結果的準確性。樣品采集應在無菌環境下開展，所使用的采樣工具和容器均應是經過完全消毒或滅菌，采集的樣品需具有代表性，符合檢驗要求。采樣人員應熟練操作，避免對樣品進行污染，采樣完成后及時記錄樣品信息，及時將樣品存放在無菌容器中并進行標記。需即刻檢測的樣品應立即送回實驗室開展檢測，對于需要暫時存儲地樣品須在規定條件下放置。在樣品運輸環節，應避免樣品在運輸和存儲過程中受到外界污染，避免樣品外溢或微生物數量發生變化。樣品從采樣到送入實驗室越快越好，最好24h內完成檢測。樣品到達實驗室后，實驗人員應先對樣品進行核對，檢查外觀是否完好。

3.6 微生物檢測外部質量控制

微生物檢測外部質量控制是對實驗室檢測水平以及實驗室檢測綜合能力的評判。實驗室外部質量控制是對微生物檢測內部質量控制的補充，更是提高微生物檢測效率的重要手段[5]。微生物實驗室外部質量控制的主要手段有國家相關部門組織的能力驗證考核、盲樣考核、國家監管部門下發的監督考核盲樣、實驗室留樣復測、仲裁檢驗、實驗室間的比對等多重形式的考核。為確保微生物檢測的實際質量，一般可將多種外部質量控制手段聯合使用，最大程度上保障微生物檢測的真實質量。

4 結語

檢測微生物時使用的快速測試片法，其操作過程較為簡單，而且在消毒保存與運輸攜帶方面也較為便利。快速測試片也較為經濟實惠，對環境也不會造成污染，這使得微生物檢測實驗室對其極為青睞，不僅能節約成本，也符合綠色化發展需求。