益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細胞凋亡干預作用實驗研究的Meta分析*

蔣 越，蒙帥杰，買鵬宇，陳 露，鄭翼馳，陳 六，王權勝

（1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530001）

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是男科臨床常見疾病之一，多見于青壯年男性，因其相關的陰囊疼痛不適、不育與睪丸萎縮等，尤其是對生育的影響，受到廣泛關注。VC具體指精索內蔓狀靜脈叢出現異常擴張、伸長和迂曲的微血管病變，可導致陰囊持續墜脹疼痛及進行性睪丸功能減退，為男性不育癥的常見原因之一[1-3]。目前，治療VC導致不育癥的措施不僅僅是手術，還包括藥物和輔助生殖技術，而且3種治療方法還可以彼此協同[4]。研究表明[5-6]，VC可導致睪丸內生精細胞凋亡，增加生精細胞凋亡異常，出現局部微循環障礙。中醫藥多采取益氣活血立法并取得了較好的療效，但對其具體療效機制尚未完全闡述清楚。動物實驗系統評價被認為在一定程度上提高了動物實驗對臨床研究的指導水平，且有助于減少其結果向臨床轉化時的風險[7]。為進一步明確中醫藥治療VC的研究機制，本研究以益氣活血類中藥為案例，采用Meta分析方法對益氣活血類中藥干預實驗性VC動物模型生精細胞凋亡進行探討，以期進一步驗證益氣活血類中藥治療VC機制的確切性，為后續研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 檢索策略計算機檢索中國知網（CNKI）、重慶維普中文科技期刊數據庫（VIP）、萬方數據知識服務平臺（WFPD）、中國生物醫學文獻數據庫（CBM），分別以精索靜脈曲張、筋疝、筋瘤、不育、中醫、中藥、中醫藥、中藥復方、益氣活血、中西醫結合、湯藥、草藥、左腎靜脈縮窄術、動物模型等為關鍵詞或主題詞檢索以上中文數據庫。以Varicocele、Varicocele infertility、Experimental Varicocele、Chinese Traditional Medicine、Traditional Chinese Medicine、Herbs、Medicinal herbs、Supplement qi and activate blood、Left renal vein ligation、Animal model等為檢索詞，英文數據庫檢索PubMed、Embase和Cochrane Library等。所有檢索運用MeSH主題詞、自由詞與布爾邏輯運算連接詞相結合的方式，采取組配、后綴、截詞等限定檢索功能，并反復完善預檢索，以確定檢索表達式，對不同數據庫進行數據轉換。檢索時限均為從建庫至2019年10月1日。

1.2 納入標準

1.2.1 研究對象 實驗性精索靜脈曲張動物（大鼠、小鼠）模型，不局限于動物模型的構建模式，設計類型為隨機對照實驗。

1.2.2 干預措施 中藥組給予益氣活血類中藥干預，不限于益氣活血類中藥給藥方式與劑型；模型組采用造模成功后等量對照溶液。所有動物均無聯合用藥，且整體實驗初始時間、實驗周期不限。

1.2.3 觀察指標（1）精子密度；（2）精子活率；（3）精子活力；（4）B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）；（5）凋亡因子（Fas）；（6）凋亡因子配體（FasL）；（7）凋亡指數（AI）；(8)Johnson評分。

1.2.4 語種限制 中文及英文。

1.3 排除標準（1）臨床研究及綜述類文獻；（2）離體實驗研究；（3）實驗數據從文中無法提取或實驗結果由于采用圖示而無法獲取其具體數據，且聯系原作者未能全面提供數據信息，無法開展整理分析的文獻研究；（4）干預措施中出現非益氣活血類中藥治療，如西藥、針灸等；（5）重復發表的文獻，根據文獻信息保留至少1篇研究納入Meta分析；（6）文獻中精索靜脈曲張模型合并其他基礎疾病；（7）實驗分組中無對照組的實驗研究；（8）會議論文及摘要。

1.4 文獻提取由2名具備實驗研究專業基礎知識的研究評價員進行獨立資料提取，包括論文第一作者、發表時間、動物種類品系、性別、樣本量、造模方法、藥物劑量、干預措施及相關結局指標等，并進行交叉核對。

1.5 風險評估雖然目前尚未有動物實驗注冊中心或訪問查詢研究計劃書公開發表數據庫，但SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具仍然將選擇性結果報告作為其條目之一，且其涵義與Cochrane偏倚風險評估工具內容相符[8]。本研究采用SYRCLE動物實驗偏倚風險評估工具推薦的6大類偏倚類型共10個細則進行評估：選擇性偏倚（序列產生、基線特征、分配隱藏）；實施偏倚（動物安置隨機化、盲法）；測量偏倚（隨機性結果評估、盲法）；失訪偏倚（不完整數據報告）；報告偏倚（選擇性結果報告）；其他偏倚（其他偏倚來源）。評估結果中低風險偏倚、高風險偏倚和不確定風險偏倚分別以“是”“否”與“不確定”代表[9]。

1.6 統計學方法采用Cochrane協作網的RevMan 5.3軟件進行Meta分析。計量資料以標準化均數差（SMD）或均數差（MD）作為合并效應量，各效應量均采用95%可信區間（CI）表示。運用χ2檢驗分析各實驗研究之間的異質性，若P＞0.10且I2＜50%時，采用固定效應模型進行Meta分析；若P≤0.10和/或I2≥50%時，應先分析異質性產生的原因，并采用亞組分析或敏感性分析等方式進行數據處理，若仍無法消除異質性資料，可謹慎使用能進行合并分析的隨機效應模型。Meta分析的檢驗水準為α=0.05。最后，繪制漏斗圖對納入文獻的偏倚程度進行評價分析。

2 結 果

2.1 文獻篩選結果共檢索出中文文獻853篇，英文文獻238篇，共1 091篇。剔除重復文獻432篇，閱讀文題及摘要篩除臨床研究、綜述、離體實驗研究文獻共521篇，閱讀全文剔除干預措施中出現非益氣活血類中藥治療、無對照組實驗、合并其他基礎疾病、實驗研究指標及數據不明確、會議論文、同一文獻重復發表共123篇，最終納入文獻15篇[10-24]，所有研究均在中國進行，均以中文形式發表。具體文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程及結果

2.2 文獻基本特征納入的所有研究為隨機對照實驗，且均在建模成功后給藥，共15篇[10-24]。10項研究[10,13,16,18-24]采用SD大鼠建立VC動物模型，5項研究[11-12,14-15,17]采用Wistar大鼠建立VC動物模型。所有研究造模方式均結扎部分左腎靜脈，觀察療程為1~3個月，結局指標有精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2、Fas、FasL、AI、Johnson評分。所有納入研究的文獻基本特征詳見表1。

表1 15篇益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細胞凋亡干預作用實驗研究文獻基本特征

2.3 文獻質量評價15項研究中僅有7篇文獻均采用隨機數字表法，其余實驗研究中動物是否被隨機分配存在著不確定因素。經篩查所有研究后得知，針對動物基線特征、動物研究計劃書報告及益氣活血類中藥干預后模型評估報告充分，但在分配隱藏、盲法研究等內容報告不充分，且無法判定存在其他偏倚，故不足以明確其潛在偏倚風險，具體見表2。

表2 15篇益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細胞凋亡干預作用實驗研究文獻文獻質量評價結果

2.4 Meta分析結果為系統比較不同劑量下益氣活血類中藥對VC動物模型結局指標的干預作用，根據納入的15篇文獻研究設定亞組分析，分別為低劑量組（0.5~0.7 g/mL）、中劑量組（1.0~1.2 g/mL）和高劑量組（1.4~2.4 g/mL）。鑒于精子活力、Fas、FasL、Johnson評分指標納入文獻較少，故未進行敏感性分析。對其余各項指標進行敏感性分析，結果顯示，各指標的敏感性分析與原結果相同，且有較好的穩定性。（見表3）

表3 15篇益氣活血類中藥對精索靜脈曲張動物模型生精細胞凋亡干預作用實驗研究中結局指標Meta分析結果

2.4.1 精子密度8項研究[10,13,16,19-23]報告了精子密度水平。隨機效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可提升實驗后雄性模型大鼠的精子密度[SMD=2.63，95%CI（1.95，3.32），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.000 01）。

2.4.2 精子活率7項研究[10,13,16-17,19,21-22]報告了精子活率水平。固定效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可提高實驗后雄性模型大鼠的精子活率[SMD=2.38，95%CI（1.87，2.88），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.000 01）。

2.4.3 精子活力2項研究[13,23]報告了精子活力水平。固定效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可逐漸增強實驗后雄性大鼠的精子活力[SMD=2.88，95%CI（2.38，3.38），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.000 01）。

2.4.4 Bcl-2 4項研究[10,14-15,23]報告了Bcl-2水平。隨機效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可有效促進實驗后雄性模型大鼠的Bcl-2表達水平，進而抑制生精細胞凋亡[SMD=1.29，95%CI（1.02，1.57），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

2.4.5 Fas 2項研究[10,15]報告了Fas水平。固定效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可在一定程度上降低實驗后雄性模型大鼠的Fas表達水平，繼而有效控制生精細胞凋亡進程[SMD=-0.90，95%CI（-1.26，-0.54），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.000 1）。低劑量組分別與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4.6 FasL 2項研究[10,15]報告了FasL水平。隨機效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可在一定范圍內減少實驗后雄性模型大鼠的FasL表達水平，從而延緩生精細胞凋亡[SMD=-2.74，95%CI（-3.55，-1.94），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中、低劑量組分別與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.0001）。

2.4.7 AI 5項研究[11-14,24]報告了AI。文獻[12]與文獻[14]為同一作者相同實驗，AI指數數據一致，故納入其中1項研究的AI指數。隨機效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可下調實驗后雄性模型大鼠的AI[SMD=-1.53，95%CI（-1.88，-1.19），P＜0.000 01]。本研究進一步顯示，高、中、低劑量組與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.000 01）。

2.4.8 Johnson評分2項研究[18-19]報告了Johnson評分。隨機效應模型中Meta分析結果示，益氣活血類中藥可有效提高實驗后雄性模型大鼠Johnson評分[SMD=0.46，95%CI（-1.35，2.26），P=0.01]。本研究進一步顯示，高劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P=0.34）。中劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P=0.01）。

2.5 文獻發表偏倚根據益氣活血類中藥對模型組精子密度、精子活率兩項結局指標繪制漏斗圖，分別以納入研究的標準化均數差SMD值為橫坐標，標準誤SE為縱坐標。其中精子密度指標屬于隨機效應模型，故制作倒漏斗圖；精子活率指標屬于固定效應模型，故制作漏斗圖。圖2示，精子密度水平倒漏斗圖基本不對稱，可能存在一定偏倚；圖3示，精子活率水平漏斗圖稍不對稱，提示進行Meta分析結果可靠性較高。

圖2 精子密度變化的倒漏斗圖

圖3 精子活率變化的漏斗圖

3 討 論

近年來，VC導致不育的關鍵細胞分子機制為睪丸內生精細胞凋亡及凋亡異常增加，然而生精細胞凋亡在正常的生精過程中是存在的，以適當維持支持細胞與生精細胞的數量平衡，并清除過多及DNA損害嚴重的生精細胞[25]。調控凋亡因子在精子發生過程中起到一定作用，Johnson評分與凋亡指數（AI）也可以體現凋亡因子與生精功能障礙存在相關性[26-27]。目前，相關研究表明由細胞膜上死亡受體（death receptor，DR）介導的死亡受體通路是細胞凋亡的重要機制，Fas、Fas配體（FasL）蛋白是該途徑的核心蛋白，能直接反映凋亡的狀態[28-29]。其次，有研究指出凋亡蛋白Bcl-2在成熟精子中具有強陽性的表達，并對凋亡有抑制作用[30]。通過VC模型模擬臨床發病，采取部分結扎左腎靜脈的方式建立VC模型，探究下游相關細胞凋亡是當前對于生精細胞功能研究的主要途徑。目前，有學者運用數據挖掘探討VC中醫治法規律時發現，治以活血化瘀為主，兼以調理氣血，調節各臟腑功能[31]。另有研究指出益氣活血類中藥對于局部微循環改善有較好的調節作用，并對凋亡因子的調節也有一定程度的影響[32-34]。本研究結果顯示，與模型組比較，益氣活血類中藥能夠有效提高精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2蛋白水平，降低Fas、FasL、AI，改善Johnson評分。此外，不同劑量的益氣活血類中藥對模型大鼠Bcl-2、Fas、AI和Johnson評分的影響存在療效差異，體現了一定的量效關系。

本研究存在以下局限：（1）盡管本研究納入了精子密度、精子活率等8個結局指標的文獻，但受納入文獻質量與數量因素的影響，尚不能系統全面地評價益氣活血類中藥干預VC模型的療效水平；（2）納入研究中出現重復數據，體現當前此項研究具有團隊單一、靶點單一、指標單一的特點，這對分析結果的推廣造成不利影響；（3）其他作用類中藥亦對VC模型生精細胞凋亡具有較好療效，但本研究僅收集納入文獻中較具有代表性的益氣活血類中藥，在一定程度上Meta分析結果存在偏倚；（4）由于諸多研究者在中藥及復方干預實驗中對動物實驗系統評價方法認識存在不足，繼而可能存在較高的異質性及潛在的偏倚風險，也導致相關文獻（含英文）因未提供具體指標數據而不得納入；（5）目前尚未見有關中藥干預VC模型的Meta分析及系統評價，故本研究對文中部分指標評價具有一定的風險差異。

綜上所述，現有相關證據表明，益氣活血類中藥可有效提高VC模型睪丸及附睪組織精子密度、精子活率、精子活力、Bcl-2表達水平，并降低Fas、FasL、AI，改善Johnson評分。但納入的研究尚存在一定的方法學缺陷，還有待高質量的隨機對照研究來予以驗證。