通管丸含藥血清對巨噬細胞炎癥模型磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白表達的影響*

龔 倩，匡繼林，張 翼

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

輸卵管炎性阻塞性不孕（salping obstruent infertility，SOI）是指各種致病菌如生殖道支原體、沙眼衣原體和淋病奈瑟菌等作用于輸卵管，使輸卵管黏膜破壞，或傘端黏連，引起管腔變形、瘢痕形成，甚者與周圍組織器官形成粘連，從而使精卵細胞的結合或受精卵運送至宮腔受阻導致的女性不孕[1]。近年來，性傳播疾病和宮腔手術逐年增加，患有SOI的女性越來越多，嚴重影響患者身心健康及其家庭關系[2]。

通管丸是在謝劍南教授治療SOI的經驗方——通管方的基礎上所制成。本課題組前期證實通管方對改善輸卵管炎性阻塞性不孕有顯著療效[3]。后逐漸開展了通管方治療輸卵管炎性阻塞性不孕的動物實驗研究、藥理研究，證實通管方能降低模型大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量[4-5]，并通過降低或抑制輸卵管上皮EGFR、ICAM-1、BAX表達而達到治療SOI的目的[6-7]。但通管丸治療SOI的具體機制尚不明確，因此本課題通過檢測通管丸含藥血清對巨噬細胞炎癥模型中磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白表達水平的影響，探討通管丸對介導炎癥反應TLR2/MyD888/NF-κB信號通路的影響，從蛋白質分子水平對通管丸治療SOI的作用機制進行闡明，為中醫藥防治SOI提供切實可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8～12周健康SPF級Wistar雌性大鼠10只，體質量（191.84±7.73）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，均飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室，溫度22～26℃，相對濕度30%～70%，保持實驗室內環境安靜，通風干燥。實驗開始前適應性喂養大鼠3 d。

1.2主要藥物及試劑 通管丸藥物組成：穿破石20 g，黨參15 g，茺蔚子10 g，白術15 g，當歸10 g，薤白10 g，丹參10 g，赤芍10 g，澤蘭10 g，乳香10 g，香附10 g，沒藥10 g，王不留行10 g，路路通10 g，甘草5 g，三七5 g，穿山甲7 g。以上所述中藥均由湖南中醫藥大學第二附屬醫院的中草藥房提供。本課題組前期實驗研究證實通管丸混懸液高劑量組對SOI的炎癥抑制最顯著[7]，根據“人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表”折算出大鼠的給藥高劑量為18.9 g/kg；兔多抗P-IRAK4（60 KDa）（Affinity，批號：DF7567）；兔多抗P-IKK（85KDa）（Affinity，批號：AF3013）。

1.3 主要儀器JY3002型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；CO2恒溫培養箱（Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（BIORAD）；電泳儀（芬蘭雷勃）；FlexStation 3多功能酶標儀（Molecular Devices）；微型高速離心機（美國Labnet）；醫學圖像分析系統（Motic 6.0）等。

1.4 血清的制備將10只大鼠按照隨機數字表法將其分為實驗組和對照組，每組5只。用蒸餾水配置通管丸浸膏高劑量混懸液（1.26 g/mL），實驗組大鼠予通管丸高劑量混懸液（18.9 g/kg）灌胃，對照組大鼠予等量生理鹽水，2次/d，連續3 d。在最后一次給藥1 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠四肢固定，解剖，腹主動脈采血4 mL，離心后取上血清，56℃水浴30 min滅活，-20℃低溫冷藏備用。

1.5 最佳含藥血清濃度檢測將武漢巴菲爾生物技術服務有限公司所贈RAW264.7細胞隨機分為9組，正常培養組、無藥血清組（5%、10%、20%、40%）和含藥血清組（5%、10%、20%、40%），每組設3個復孔。正常培養組添加10%胎牛血清；無藥血清各組分別添加5%、10%、20%、40%濃度的無藥血清，含藥血清各組分別添加5%、10%、20%、40%濃度的含藥血清，放入恒溫培養箱中培養24 h，CCK8法檢測最佳含藥血清濃度[8]。

1.6 RAW264.7細胞炎癥模型制備參考文獻[9]方法，將RAW 264.7細胞隨機分為造模組和非造模組，每組設8個復孔。造模組的培養基中添加100 ng/mL的LPS，非造模組培養基中添加等量的PBS溶液。誘導24 h后，觀察各組細胞形態變化。將各組離心后取上清液，采用ELISA方法檢測兩組上清液中TNF-α、IL-1β的含量，確定100 ng/mL的LPS是否能夠成功制造巨噬細胞體外炎癥模型。

1.7 Western blotting檢測磷酸化IRAK4、磷酸化IKKS蛋白相對表達量將培養的RAW264.7細胞隨機分為5組，空白對照組、NF-κB阻斷劑組、PPAR-γ激動劑組、無藥血清組、含藥血清組，每組設6個復孔。空白對照組：正常RAW264.7細胞+10%胎牛血清；NF-κB阻斷劑組：造模后的RAW264.7細胞+20 μmol/L NF-κB阻斷劑SN50；PPAR-γ激動劑組：造模后的RAW264.7細胞+20 μmol/L吡格列酮；無藥血清組：造模后的RAW264.7細胞+10%無藥血清；含藥血清組：造模后的RAW264.7細胞+10%含藥血清；將各組放入恒溫培養箱培養24 h后，Western blotting檢測磷酸化IRAK4、磷酸化IKKS蛋白相對表達量[10]。

1.8 統計學方法采用統計軟件SPSS 21.0進行統計分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 正常RAW264.7細胞形態學觀察培養24 h后鏡下觀察細胞形態，可見貼壁細胞胞體較小，呈圓形或橢圓形，少量細胞可見偽足或突起，單核，呈明顯的RAW264.7細胞形態。（見圖1）

圖1 正常RAW264.7細胞形態

2.2 不同濃度含藥血清對RAW264.7細胞活力影響的比較與正常培養組比較，10%無藥血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組和20%含藥血清組細胞活力明顯增加，而40%無藥血清組、40%含藥血清組RAW264.7細胞活力明顯降低（P＜0.05）；5%無藥血清組、20%無藥血清組細胞活力與正常培養組比較無明顯變化（P＞0.05）。與10%含藥血清組比較，5%含藥血清組、20%含藥血清組和40%含藥血清組的細胞活力明顯降低（P＜0.05）。因此濃度為10%的血清為最佳濃度含藥血清。（見表1、圖2）

表1 各組RAW 264.7細胞活力比較（±s，%）

表1 各組RAW 264.7細胞活力比較（±s，%）

注：與正常培養組比較，aP＞0.05，bP＜0.05；與10%含藥血清組比較，cP＜0.05

組別 n 細胞活力正常培養組 3 100 5%無藥血清組 3 98.75±3.07a 10%無藥血清組 3 108.31±2.13b 20%無藥血清組 3 103.09±2.51a 40%無藥血清組 3 94.52±3.37b 5%含藥血清組 3 106.87±2.91b c 10%含藥血清組 3 118.30±0.41b 20%含藥血清組 3 109.69±4.94b c 40%含藥血清組 3 78.12±5.37b c

圖2 各組RAW 264.7細胞活力比較

2.3 RAW264.7細胞形態變化誘導24 h后鏡下觀察，非造模組RAW264.7細胞無明顯變化，造模組RAW264.7細胞呈梭形或長梭形改變，大量細胞呈現偽足或突起，胞體內可見吞噬小泡呈炎癥反應變化。（見圖3）

圖3 各組RAW264.7細胞形態變化（×100）

2.4 各組RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β蛋白含量比較與非造模組比較，造模組TNF-α、IL-1β含量明顯增加（P＜0.05），結合鏡下RAW264.7細胞形態學變化，由此表明巨噬細胞體外炎癥模型造模成功。（見表2）

表2 各組RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組RAW264.7細胞TNF-α、IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

組別 n TNF-α IL-1β非造模組 8 15.096±1.186 8.178±0.285造模組 8 67.371±1.602 24.589±0.184

2.5 各組RAW264.7細胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相對表達量比較與空白對照組比較，無藥血清組、NF-κB阻斷劑組、PPAR-γ激動劑組、含藥血清組中磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白含量明顯升高（P＜0.05）；與無藥血清組比較，NF-κB阻斷劑組、PPAR-γ激動劑組、含藥血清組RAW264.7細胞中磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白含量均降低（P＜0.05）。（見圖4、表3）

表3 各組RAW264.7細胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組RAW264.7細胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與無藥血清組比較，bP＜0.05

組別 P-IKKs/β-actin P-IRAK4/β-actin空白對照組 0.093±0.018 0.135±0.039無藥血清組 0.453±0.036a 0.608±0.012a NF-κB阻斷劑組 0.342±0.03a b 0.452±0.048a b PPAR-γ激動劑組 0.259±0.026a b 0.316±0.030a b含藥血清組 0.236±0.025a b 0.420±0.033a b

圖4 各組RAW264.7細胞磷酸化IRAK4、磷酸化IKKs蛋白表達

3 討 論

SOI屬中醫“斷緒”“無子”“痛經”及“癥瘕”的范疇，其發病以氣滯血瘀為核心病機，氣血運行不暢，氣滯則血瘀，沖任、胞脈不通，精卵不能交融而致不孕。因此治療本病重在“活血化瘀通絡”，通過改善輸卵管血液循環，促進輸卵管的炎癥吸收，達到治療SOI的目的。

通管方中穿破石有活血化瘀、通絡止痛、解毒消腫之功效。現代藥理研究發現穿破石具有顯著的鎮痛抗炎作用，并且穿破石能夠抑制輸卵管組織的炎癥反應，促進病變輸卵管上皮細胞的增生修復[11]。穿山甲氣腥而竄，貫穿經絡，通滯散結。二者共為君藥，能夠加強活血化瘀、消癥散結之功效。當歸養血活血調經；丹參活血祛瘀，理氣調經，涼血消癰；茺蔚子調經明目；三七通脈行瘀定痛。四藥共為臣藥，意在疏通血脈，流動氣血，使氣血調和，經自通也。香附疏肝理氣；赤芍散瘀止痛，涼血消腫。薤白行氣導滯，通陽散結；乳香活血，沒藥散血，皆能定痛消腫生肌；路路通和血通竅；澤蘭活血祛瘀行水。黨參、白術補氣健脾。諸藥共為佐藥，加強君藥、臣藥之效，并且使其化瘀而不傷正。甘草為使藥，起到調和諸藥之效。諸藥合用化瘀消癥，通經活絡，能夠攻邪不傷正，扶正不留邪，使輸卵管復通，沖任得以調達而攝精受孕。

研究表明TLR2/MyD88/NF-kB信號轉導通路介導的炎癥反應在輸卵管炎性病變發生、發展及預后的過程中，發揮了重要的作用[12]。TLR2與配體結合后，向MyD88蛋白傳導信號，MyD88進一步募集IRAKs家族，其中IRAK4是依賴于MyD88激活的關鍵蛋白分子，磷酸化的IRAK4與TRAF6形成復合物，使TRAF6產生低聚作用，進一步通過銜接蛋白TAB激活TGF-β與NIK，活化的NIK進而磷酸化IKKs，磷酸化的IKKs催化IκB蛋白磷酸化，隨后IκB蛋白被降解，使NF-κB從IkB/NF-κB復合物中被釋放出來，從而NF-κB得以激活，活化的NF-κB引起促炎細胞因子基因的轉錄和表達，使大量的炎性細胞和炎癥介質積聚浸潤于炎癥部位，導致炎癥反應的持續和放大[13]。IRAK4和IKKs在TLR2/MyD88/NF-κB介導的信號通路中有著承上啟下的作用。研究發現在R848、LPS及IL-1的作用下，IRAK4激酶失活的模型組小鼠的巨噬細胞在炎癥反應中的趨化因子和炎性因子的mRNA穩定性明顯降低[14]。研究發現IKKs催化亞基IKKα和IKKβ的基礎活化質粒表達本身即可誘導NF-κB活化，而失活質粒的表達則顯著抑制NF-κB的活化[15]。

本課題前期實驗研究表明通管方能降低SOI模型大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量，并通過降低或抑制輸卵管上皮EGFR、ICAM-1、BAX表達而達到治療SOI的目的。本研究發現給予通管丸含藥血清后，磷酸化IRAK4和磷酸化IKKs蛋白的表達明顯降低，因此推斷通管丸可能通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路中“關鍵元件”磷酸化IRAK4和磷酸化IKKs蛋白的表達，從而達到抑制炎癥反應的目的。