脾虛濕盛肝郁證潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立與評價*

李藝垚，馬少丹，苑述剛

（福建中醫藥大學，福建 福州 350122）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是臨床常見疑難病，其發病期和緩解期交替發作，主要表現為腹痛腹瀉、黏液膿血便，或伴有腹脹、乏力、發熱等[1]。根據其臨床癥狀分析，該病應屬中醫“泄瀉”“痢疾”“腹痛”等范疇。本課題組主要致力于研究久瀉寧顆粒對潰瘍性結腸炎的治療作用及機理研究，久瀉寧顆粒是原福建中醫學院院長、全國著名中醫藥專家俞長榮教授治療慢性泄瀉的經驗方，由參苓白術散與痛瀉要方加減化裁而來，以健脾滲濕、調氣止瀉為法，臨床治療脾虛濕盛肝郁證UC療效確切。建立合適的動物模型是研究疾病規律與藥物療效的基礎，目前常見的UC中醫證候模型有肝郁脾虛證[2]、脾虛濕困證[3]、濕熱蘊結證[4]等。在前期相關研究中，課題組常采用三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇法或免疫復合物聯合法制備UC大鼠模型，雖可體現UC的病理特點，但未考慮中醫證候特點，且存在模型不穩定易自愈或造模周期長等缺陷。故本實驗欲采用DSS溶液定量灌胃反復誘導的同時結合飲食、環境等因素干預希望建立與本課題研究對象相似的脾虛濕盛肝郁證UC模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物7周齡SPF級SD大鼠45只，雌雄各半，體質量（170±20）g，由浙江省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001。實驗動物在福建中醫藥大學動物實驗中心飼養和管理，環境設施合格證號：SYXZ（閩）2014-0005。所有實驗研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則，通過福建中醫藥大學倫理委員會審定，實驗倫理批號：[2019]福中醫倫理審字第（022）號。

1.2 藥物與試劑葡聚糖硫酸鈉（DSS，大連美侖生物技術有限公司，批號：S0808A）；豬油（天津聚龍糧油有限公司，批號：20180912C）；0.9%氯化鈉注射液（江西科倫藥業有限公司，批號：B18120702）；IL-2試劑盒（批號：201909）、TNF-α試劑盒（批號：201903）（江蘇酶免實驗有限公司）。

1.3 主要儀器電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Thermo Fisher Heraeus Multifuge X1R臺式離心機（Thermo Electron LED GmbH）；Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；ZT-14S1型生物組織自動脫水機（亞光醫用電子技術有限公司）；YJ-BMC型生物組織石蠟包埋機（湖北錦源醫用電子技術有限公司）；Leica RM2235型輪轉切片機（德國Leica公司）；YT-7FB型攤烤片機（孝感亞光醫用電子技術有限公司）；DM4000B型研究級生物顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4 造模與分組45只SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（n=10）、葡聚糖硫酸鈉（DSS）組（n=10）、病證結合組（n=10）、模型組（n=15）。參照相關文獻方法[5-7]并加以改進，制備UC大鼠模型：正常對照組予正常飼養，每日予生理鹽水灌胃2次，2 mL/次，連續19 d。DSS組大鼠每日灌胃10%DSS溶液20 mL/kg，2次/d，連續7 d，建立急性潰瘍性結腸炎模型，予正常飼養5 d，第13天再次灌胃10%DSS溶液20 mL/kg，2次/d，連續7 d，誘導復發。病證結合組大鼠予單日禁食，并4℃冰水灌胃，1次/d，2mL/次；雙日正常飲食，并予豬油灌胃1次，2 mL/次，每日用紗布包裹長尾夾夾住大鼠尾部，30 min/次，使其暴怒，強迫大鼠站立在2 cm深的水中至少8 h，連續19 d。模型組大鼠采用DSS組結合病證結合組造模方法。造模完成后，正常對照組、DSS組、病證結合組、模型組各取10只大鼠第20天禁食不禁水24 h，取材進行病理觀察。模型組剩余5只大鼠繼續正常飼養14 d，取材進行病理觀察。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 造模期間觀察各組大鼠一般情況，包括體質量、精神狀態、動作行為、毛發光澤度、糞便性狀等，并按UC疾病活動指數（DAI）評分標準[8]進行評分。（見表1）

表1 DAI評分標準

1.5.2 大鼠血清中IL-2及TNF-α含量 實驗第21天，大鼠用20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，4℃，3 000 r/min，離心10 min，提取血漿上清液，-80℃保存待測。采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測定血清IL-2及TNF-α含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5.3 大鼠結腸組織病理學改變 從肛門向上截取大鼠結腸組織，沿結腸腸系膜緣縱向剪開，用生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，肉眼觀察結腸組織形態學改變，根據結腸黏膜損傷指數（CMDI）評分標準[9]進行評分，見表2。取病變最明顯處結腸組織，選取約1 cm×1 cm結腸組織，置于4%多聚甲醛固定后編號，酒精梯度脫水，二甲苯透化，常規石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色（HE染色），中性樹膠封片后，光鏡下觀察結腸病理變化。造模完成后第15天，上述方法取模型組剩余5只大鼠結腸組織，肉眼觀察結腸組織形態學改變，固定、包埋、切片、染色后鏡下觀察結腸病理改變。

1.6 模型評定

1.6.1 脾虛濕盛肝郁證模型評定標準 根據參考文獻[10-12]擬定，主癥：（1）倦怠疲乏，懶動扎堆；（2）精神萎靡，毛色光澤度下降、晦暗枯槁、稀疏易脫落；（3）便軟或溏，肛周污穢，排便時肛門紅腫，甚至脫肛；（4）行動緩慢，甚至斜行。兼癥：（1）體質量不增或增長緩慢，甚至降低；（2）飲食量減少；（3）胃腸明顯脹氣。以上癥狀出現3項主癥或2項主癥加上2項兼癥即可認為脾虛濕盛肝郁證模型復制成功。

1.6.2 UC模型評定標準 根據參考文獻[13-14]擬定，（1）DAI評分初步了解動物病癥發展的嚴重程度；（2）肉眼觀察結腸組織可見結腸充血水腫、腸壁增厚，嚴重者尚可見散落的潰瘍點；（3）病理學觀察一般表現為大量淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，腺體呈現杯狀細胞減少或消失，有隱窩膿腫和潰瘍形成；（4）血清中白細胞介素-2（IL-2）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量變化。確定UC動物模型成立與否，主要取決于上述結腸組織病理學的改變。

1.7 統計學方法采用統計軟件SPSS 23進行結果分析，計量資料以（±s）表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，組間均數的兩兩比較采用最小顯著差數LSD法，重復測量計量資料采用重復測量方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況比較DSS組大鼠造模第20天死亡1只，其肛周有大量血性污穢，考慮DSS藥物不耐受，不計入血清指標檢測數據統計，其余大鼠均正常。正常對照組大鼠精神狀態良好，反應靈活，飲食量正常，皮毛光澤順滑，糞便呈橢圓狀；模型組大鼠出現精神萎靡，蜷臥懶動，扎堆嗜睡，抓取時暴躁易怒，體質量明顯下降，大便偏稀，呈月牙狀，有白色偶可見血色膿性分泌物附著，肛周污穢等癥狀；DSS組大鼠出現精神不振懶動扎堆，大便軟或溏，肛周污穢等癥狀，皮毛變化不明顯。

2.2 各組大鼠體質量比較造模第1天，各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；第12、19天，模型組、病證結合組大鼠體質量均明顯低于正常對照組（P＜0.01）。第7、12、19天，模型組、病證結合組大鼠體質量明顯低于DSS組（P＜0.01或P＜0.05）。造模期間各組大鼠體質量的分組主效應（F=7.894）、時間主效應（F=25.526）和分組與時間的交互效應（F=30.392）均有統計學意義（P＜0.01）。（見表3、圖1）

表3 各組大鼠造模后體質量比較（±s，g）

表3 各組大鼠造模后體質量比較（±s，g）

注：F時間主效應=25.526，P時間主效應=0.000；F分組主效應=7.984，P分組主效應=0.000；F交互效應=30.392，P交互效應=0.000；與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與DSS組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 動物數（只） 第1天 第7天 第12天 第19天 F P正常對照組 10 203.80±7.20 249.68±13.89 284.08±20.44 313.57±19.20 0.427 0.514 DSS組 10 204.00±7.40 235.82±11.69 272.98±12.64 246.00±15.49a 30.567 0.000病證結合組 10 200.70±5.49 193.99±6.55ad 201.58±11.47bd 203.48±12.55bc 35.752 0.000模型組 15 201.20±6.80 191.38±7.90ad 201.94±9.39bd 196.66±9.30bc 32.454 0.000 F 0.065 7.990 9.899 13.943 P 0.978 0.000 0.000 0.000

圖1 體質量交互效應輪廓圖

2.3 各組大鼠DAI評分比較第7、12、19天，模型組、DSS組、病證結合組DAI評分均明顯高于正常對照組（P＜0.01）。第7、12、19天，模型組DAI評分明顯高于DSS組（P＜0.01）。第7、19天，模型組DAI評分明顯高于病證結合組（P＜0.01）。造模期間各組大鼠DAI評分的分組主效應（F=39.652）、時間主效應（F=97.117）和分組與時間的交互效應（F=17.343）均有統計學意義（P＜0.01）。（見表4、圖2）

表4 各組大鼠DAI評分比較（±s，分）

表4 各組大鼠DAI評分比較（±s，分）

注：F時間主效應=97.117，P時間主效應=0.000；F分組主效應=39.652，P分組主效應=0.000；F交互效應=17.343，P交互效應=0.000；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DSS組比較，bP＜0.01；與病證結合組比較，cP＜0.01

組別 動物數（只）第1天 第7天 第12天 第19天 F P正常對照組 10 0 0 0 0 - -DSS組 10 0 0.56±0.13a 0.57±0.10a 1.30±0.16a 12.168 0.000病證結合組 10 0 0.71±0.08a 0.75±0.07a 1.10±0.13a 27.746 0.000模型組 15 0 1.17±0.17abc 0.90±0.10ab 1.82±0.17abc 7.493 0.006 F 18.981 27.341 35.187 P 0.000 0.000 0.000

圖2 DAI評分交互效應輪廓圖

2.4 大鼠結腸黏膜病理改變比較正常對照組大鼠結腸紋理清晰，無損傷，組織結構完整，腺體排列整齊，間質未見水腫、充血、潰瘍；DSS組大鼠結腸黏膜表面輕度充血、水腫，糜爛較局限，偶可見針尖樣潰瘍，腺體排列紊亂，部分結構破壞，杯狀細胞消失，黏膜層局部破壞，潰瘍邊緣大量炎癥細胞浸潤，間質充血、水腫；病證結合組大鼠結腸紋理較清晰，黏膜表面偶可見充血，未見明顯潰爛，腺體排列較整齊，結構基本完整，少量炎癥細胞浸潤，間質水腫；模型組結腸黏膜充血、水腫，糜爛不同程度加重，且潰瘍點較多。模型組大鼠CMDI評分明顯高于正常對照組（P＜0.01），黏膜層潰瘍嚴重，腺體結構完全破壞，杯狀細胞消失，大量炎癥細胞浸潤，間質水腫、充血明顯且有炎癥細胞浸潤，提示造模成功。模型組CMDI評分明顯高于DSS組和病證結合組（P＜0.01）。造模完成后第15天后取模型組大鼠結腸組織，肉眼觀察結腸黏膜表面仍存在充血、水腫，可見針尖樣散在潰瘍點，黏膜層仍有缺損，腺體排列不規整，部分結構破壞，杯狀細胞減少，大量炎癥細胞浸潤，間質水腫、充血，少量炎癥細胞浸潤。（見表5、圖3）

圖3 各組大鼠結腸組織病理形態改變（HE，×200）

表5 各組大鼠CMDI評分（±s，分）

表5 各組大鼠CMDI評分（±s，分）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與DSS組比較，bP＜0.01；與病證結合組比較，cP＜0.01

組別 動物數（只） CMDI評分正常對照組 10 0 DSS組 10 1.53±0.13a病證結合組 10 0.60±0.10a模型組 10 2.25±0.14a b c

2.5 各組大鼠血清IL-2及TNF-α含量比較模型組與DSS組大鼠血清IL-2水平明顯低于正常對照組（P＜0.01），血清TNF-α濃度明顯高于正常對照組（P＜0.01）；模型組大鼠血清IL-2水平明顯低于病證結合組（P＜0.01），血清TNF-α水平明顯高于病證結合組（P＜0.01）；模型組大鼠血清IL-2水平明顯低于DSS組（P＜0.05）。（見表6）

表6 各組大鼠血清IL-2及TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表6 各組大鼠血清IL-2及TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與病證結合組比較，bP＜0.01；與DSS組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） IL-2 TNF-α正常對照組 10 33.60±1.64 1.06±0.14 DSS組 9 25.39±0.56a 4.30±0.44a病證結合組 10 30.40±1.45 1.12±0.22模型組 10 23.24±0.55a b c 5.50±0.50a b

3 討 論

中醫學認為，泄瀉發病的根本在于“脾虛”與“濕”，《素問·臟氣法時論篇》曰：“脾病者，……虛則腹滿腸鳴，飧泄食不化。”《素問·陰陽應象大論篇》曰：“濕勝則濡瀉”，治療以健脾利濕為原則。久瀉寧顆粒治療以脾虛濕盛肝郁為主的慢性泄瀉，UC中醫常見分型中并無脾虛濕盛肝郁證，這類患者多是由肝郁脾虛證泄瀉發展而來，情志過極，肝失疏泄，克犯脾土，脾失健運而致泄瀉，久而久之脾虛生濕，濕困脾土，更不能運化濕邪而加重泄瀉，或是久居濕地或飲食不節，脾土本虛，肝木乘脾，致脾更虛，清濁不分，混雜而瀉，時止時瀉，遷延不愈，此時則會表現為以脾虛濕困為主兼有肝郁的泄瀉，故久瀉寧顆粒以健脾化濕為主，調氣止瀉為輔對這類患者進行治療。此類患者常有UC病史，其病勢呈急慢性交替發作，慢性緩解期時伴有便溏不爽，身倦體重，腹脹，食少納差，脈弦等癥狀[15]，此時處于肝郁脾虛濕蘊的病理狀態。

目前常用的UC造模方法有化學刺激法、免疫因素刺激法、復合法[16]，同時在此基礎上進行飲食、環境等因素干預可復制出相應的UC中醫證候模型。DSS作為常用誘導UC模型制劑，其使用方法簡單，容易復制，且模型接近人類發病病因而被廣泛采用。DSS常采用自由飲用的方法，一般在造模第3~4天可出現腹瀉、膿血便等癥狀。但因動物個體差異，自由飲用會造成藥物攝入量、攝入時間長短不一，使模型癥狀出現時間、癥狀表現程度、結腸損傷程度不均一，不利于后續給予藥物后療效的判斷及新藥治療效果的研究。有研究[15]發現定量灌胃DSS溶液誘導的UC模型在潰瘍出現的時間、程度、位置比自由飲用均一性顯著提高。故本實驗選擇定量灌胃DSS方法誘導UC模型，控制誘導次數使模型產生急性與緩解期交替癥狀，復制UC發病周期規律。

實驗結果顯示單純使用DSS誘導的UC模型，造模后出現便稀，結腸黏膜充血水腫，血清IL-2及TNF-α水平明顯變化等符合UC病理特點，但飲食量、皮毛光澤度等一般情況未見明顯變化，缺乏中醫證候特點。單純采用中醫內外因干預方法造模誘導的模型，在體征上出現蜷臥懶動、不欲飲食、皮毛稀疏伴光澤度下降等中醫證候特點，但血清IL-2、TNF-α含量水平及結腸病理變化不明顯，與正常對照組比較，差異無統計學意義，考慮造模時間較短，尚未達到UC診斷標準。采用DSS定量灌胃反復誘導方法結合內外環境干預，在結腸潰瘍性病變的同時使模型出現精神萎靡、倦怠懶動、嗜睡、不欲飲食、毛色枯槁變硬、毛發稀疏等脾虛濕盛肝郁證癥狀；結腸黏膜病理改變出現水腫、充血、糜爛，光鏡下觀察其改變符合UC診斷，最終形成脾虛濕盛肝郁證UC大鼠模型。造模后14 d模型大鼠仍有精神倦怠、懶動、不欲飲食等癥狀，鏡下觀察結腸組織仍存在水腫、充血及不同程度缺損，證明該方法制備的UC模型具有一定的穩定性。

本實驗模型易復制、穩定性較好，并且符合UC病變機制和病程變化，避免免疫復合物模型制備過程繁瑣、制備周期長等缺點，且無TNBS-乙醇模型或DSS模型的單純細胞免疫反應、維持時間短等不足，定量灌胃還可規避因大鼠個體差異自由飲用DSS溶液導致模型結腸病變程度不同的缺陷，為較理想的UC中醫證型動物模型。