規模化豬場非洲豬瘟采樣檢測關鍵點和常見誤區

張小剛 ，虞志強 ，李雪平 ＊

（1．廣州悅洋生物技術有限公司，廣東 廣州 510320；2．廣州華醫測檢測科技有限公司，廣東 廣州 510320）

自從2018年8月國內暴發第一例非洲豬瘟（African swine fever，ASF）疫情起，規模化豬場的發展模式就從快速轉為穩健，生產流程都圍繞著ASF防控為前提。在ASF防控過程中，對非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的采樣和檢測十分重要[1-3]。截止稿前，隨著多種變異毒株的出現，國內很多大中小規模化豬場都經歷了“發病-清場-復產-發病”的過程，其中多數是由于豬場ASFV采樣存在交叉擴散，以及檢測不及時、不準確、檢不出等原因造成的[4-5]。

因此，文章總結了當前規模化豬場現場采樣和檢測的一些關鍵點和常見誤區，以期防止國內規模化豬場再次出現“發病-清場-復產-發病”無限死循環的現象。

1 豬場ASFV采樣關鍵點及注意事項

1.1 豬場采樣規范

1.1.1成立應急采樣專業隊

中大型豬場應根據場內人員編制，提前成立應急采樣專業隊，可以由飼養員組成（可考慮各組/環節抽人組成，可兼任日常異常豬場采樣監控），采樣專業隊建議由隊長、副隊長及4名隊員組成（分兩組進行，風險高低分開），隊長和副隊長分別帶隊進行采樣并監控隊員采樣規范性，并具有采樣防污染及發生污染應急處理能力；應急采樣隊可以根據實際情況兼任本公司區域內其他豬場的采樣（最好省內，考慮到人員能否及時到位），特殊情況除外，有條件的盡量配備應急采樣專業隊。

1.1.2采樣培訓、準備到位

平時培訓好采樣專業隊對豬只（大欄/定位欄、大中小豬只、血液/唾液/咽拭子）、環境（重點是豬舍內區域，包括但不限于欄桿、過道、風機、門把手、工具、水鞋等）的采樣，準備好采樣方式使用的棉拭子、紗布等。在豬場出現異常情況下，人員能夠快速到位組建采樣隊，確保在最短的時間里完成豬群幾輪的普篩，第一時間找到感染豬只。

1.1.3采樣效果監控與評估

采樣專業隊隊長及副隊長應該由公司負責技術的一把手考核認定，具有全部類型標準采樣操作能力，隊長對隊員們采樣是否規范進行培訓和考核，并對他們進行打分，盡可能減少可知錯誤采樣操作，要求全部隊員都能通過考核后才算采樣隊成立。豬場要時刻注意是否在過程中需要后補人員，防止隊員在需要時出現特殊情況，通常需要提前多預留一些人員進行培訓考核，保障發生異常情況時人員能夠及時補充。

1.1.4關注采樣準確性

采集唾液時，豬只咀嚼時間不得小于10 s，確保收集到足夠量的唾液。采集咽拭子時，應用棉絨拭子快速捅到咽喉，防止采集到的大部分是唾液，最好拔出時觀察是否有黏液（鼻涕狀），若沒有，建議重新采一次。唾液或咽拭子采樣盡可能控水斷料，控水盡可能在30 min以上，不喂料有利于豬只唾液分泌，另外也促進豬只應激，激發排毒作用，有利于提高部分豬只的檢出率。

采集血液準，雖然前腔靜脈血、耳根血較尾根血較準，但前兩者相對操作較難，通常需要保定豬操作，若大批量采集仍建議尾根血較為穩妥，不過采尾根血也注意保護自身，避免血滴落到鞋上而擴散到其他區域（通常操作完一條過道盡可能換一次鞋套等）。

環境采樣要求在消毒前或者與上一次間隔12 h（經驗值）后采樣，避免消毒藥對檢測帶來的影響。一般來說，在豬場各個區域都需要日常消毒，但監控環境是否帶毒，需要避免消毒藥（破壞核酸的消毒劑氯制劑、過氧乙酸、燒堿）的影響[6]。如果采集的樣品中含有消毒藥，那消毒藥可能將采集到的核酸降解，這樣可能會結果誤判，影響下一步的環境消毒。應注意如果采用戊二醛等無法裂解核酸的消毒藥，如果之前環境樣檢出陽性，那無論采用這些消毒藥消毒多久，此時采樣必要性不強（屬于無效采樣）。采樣要在理論上行得通，而不是一刀切，一“采”到底。

1.1.5采樣隊自身防護與監控

采樣隊進出豬舍、豬舍內操作以及當天跨單元/棟等須嚴格控制防止交叉污染，做好沖涼、穿戴防護服、手套（膠手套+PE手套）、鞋套操作流程，防止擴散（這些都有正確的標準操作程序，需要注意）；每次采樣結束后，每個采樣隊員對自身頭發、臉、手、鞋底、外衣褲等進行采樣，評估采樣過程中是否存在污染擴散的現象，此過程可以通過專業采樣隊員互相協助采樣，盡量采樣精準到位。

1.1.6豬場非洲豬瘟采樣方面注意事項

小型豬場（低于1 500頭母豬）建議各區域有采樣責任人，必要時可以考慮全員皆“兵”，既所有干部員工都非常熟悉采樣的全部流程；另外無論豬場大小，平時都需要做好日常異常/非正常豬只采樣監測；任何采樣隊在采樣過程都可能會出現擴散的可能，因此無論任何一種采樣方式都需要嚴格監控人員操作（監控方式可以雙崗制、視頻監控如配執法儀等，方便后續復盤與改正），避免污染擴散。

1.2 豬場送樣規范

1.2.1編號信息完整簡潔

采樣管（不同規格EP管）清晰表明樣品信息編號，編號通常由場部根據棟舍規定，如第1棟用A1→An；第2棟用B1→Bn，以此類推。若實驗室為區域實驗室（涉及多個豬場，應在前面表明好豬場代號，最好也是單個字母），其次各區域將編碼對應的唾液/咽拭子/血液/環境等類型對應，并且注明豬只欄號或具體環境區域，再由豬場統一將送檢表發至實驗室。具體見表1。

表1 豬場樣品送檢表及舉例說明

1.2.2樣品固定防污染

為防止樣品溢撒，要求樣品編號好放入樣品盒中進行固定，并且對EP管蓋再一次進行按壓，確保管蓋蓋緊，在送樣過程不會被震動崩開。通常多數豬場很少配備足量的樣品盒，可采用硬皮紙板/泡沫板替代（根據PE管大小間隔插孔）編號插入后，將蓋子再按壓一次，確保都蓋緊后，再在蓋子上方用一層未插孔的硬皮紙板/泡沫板蓋住，用橡皮筋捆綁好，并在其上次標注好采樣時間、編號、區域和各類型樣品份數以及總份數。

1.2.3場內送樣流程可控

樣品由生產線送至豬場大門口過程中，要確保單向流程，樣品做好雙層包裝，避免存在潛在風險傳播到不同區域，尤其是大門口。整個傳遞過程由專人負責，防止交叉污染。

1.2.4送實驗室規范

將上述樣品，由場部統一收集，按規定時間送樣，安排專車第一時間送至實驗室（各豬場按實際情況確定，最好15:00前送樣，及時送樣可以在當天出結果）。要根據實驗室人員、設備、檢測項目、檢測強度等情況，合理安排樣品送檢數，避免樣品長時間存放或實驗員夜班疲勞檢測，影響樣品檢測的及時性和準確性。若實驗室較近且實驗室能第一時間檢測，樣品盒可考慮不用加冰；若實驗室較遠或者實驗室待檢樣品過多（同時檢測幾個豬場樣品等特殊情況），需要在樣品盒中加入適當的冰塊。

2 豬場ASFV檢測關鍵點及注意事項

2.1 專業人員操作

2.1.1實驗員持證上崗

實驗操作人員需要培訓合格上崗，非專業人員可能會存在漏檢，錯位檢、錯誤檢等情況，影響檢測準確性和時間性，大大影響到實際生產過程中的“拔牙”/隔離等操作。了解樣品檢測混樣檢測原則，通常核酸混樣不超過5個。抗體不得混樣。

2.1.2掌握新技術手段

由于ASFV變異毒株的大量出現，傳統單重PCR不能滿足變異毒株的鑒定，并且部分未及時采樣豬只檢測后，會出現抗原無法檢出，但抗體能檢出的情況。因此在當前背景下，要掌握多重PCR、抗原抗體同步檢測以及微滴數字PCR等多項新技術手段，確保能夠準確鑒定、檢出，甚至實現痕量核酸的檢出。

2.1.3定期培訓與考核

定期（最好半年）對實驗員進行理論和實操等方面進行培訓考核，包括操作流程、各類實驗設備儀器的操作和使用，結果的準確判斷，異常情況處理等，盡可能減少緊急狀況下出現異常結果，讓實驗室的檢測結果有真實指導意義，而非誤導。

2.1.4儀器設備精密高效

要求檢測抗原抗體儀器設備（含移液槍、漩渦器等）要具有設備穩定、準確性高、壽命長、性價比高以及與試劑盒磨合度高等多種優勢。移液槍需要定期校準，并且每次實驗結束后要調至最大刻度，防止彈簧壓死，影響移液準確性。

2.1.5試劑盒選擇要科學合理

用于ASFV抗原抗體檢測的試劑盒必須具備批內和批間穩定性高，靈敏度高、準確性高、性價比高等特點，確保能將不同變異毒株準確檢測出來。包括病毒DNA/RNA提取試劑盒、鑒別ASFV野毒株和CD2V/MGF基因缺失毒株三重熒光PCR檢測試劑盒、非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒（UNG）、非洲豬瘟抗體間接ELISA檢測試劑盒（p30）、非洲豬瘟抗體C-ELISA檢測試劑盒（p54）等多種抗原抗體檢測試劑盒，用于對豬場不同毒株的檢測。

2.2 實驗數據精準分析

2.2.1檢測結果判定準確

實驗室人員要根據檢測試劑盒說明書將實驗結果準確判定，如對擴增曲線的讀取和異常評估，通過CT值判斷陰性、可疑和陽性值以及對抗體陽性值的計算和判定，這些需要實驗員都熟透于心，確保不出現任何差錯。

2.2.2異常結果復檢合理化

對于異常數據，實驗員對原樣品需進行一次復檢，包括對核酸提取和反應擴增等，若復檢檢測陰性，則判斷陰性。若復檢結果仍然出現異常，要根據結果果斷判斷是否要求豬場進行同1頭豬只再采樣（適當時候可以結合環境樣/血液樣同步評估），重復采樣后根據檢測結果，實驗室給出具有指導意義的檢測結果。

2.2.3豬場非洲豬瘟檢測方面注意事項

CT值容易因為樣品被生理鹽水等的稀釋導致升高，如果樣品稀釋過多，雖不影響陽性判斷，但容易影響現場對下一步的操作，比如“拔牙”的力度和區域等。

2.3 實驗室防污染

實驗室容易受到實驗樣品、陽性對照、實驗操作、擴增產物、樣品廢棄物等的污染，如果處理不當，很容易造成檢測結果出現異常[7-8]。尤其在當前病毒低毒株橫行的時期，如果實驗室污染造成實驗結果陽性偏多，那對于豬場“拔牙”損失也是巨大的，所以實驗室防污染是十分重要的。

2.3.1選用防污染的檢測試劑

如為防止PCR室擴增產物的污染，可以選用加入UNG酶的試劑盒，可大大減少擴增產物的氣溶膠污染。

2.3.2實驗員操作規范

實驗員需要具有很強的生物安全意識。正常情況下，進入到實驗室需要沖涼更衣，這些大型企業是具備條件的。但中小型豬場實驗室目前不具備這種條件，這就需要實驗前洗手（或者消毒濕紙巾擦拭手臉等）、換實驗服以及換鞋等操作，盡可能防止外界將風險傳到實驗室內，又可以避免實驗室污染擴散到外界。

樣品預處理需要特別小心實驗污染，如唾液大棉簽可以采取螺絲釘方式進行離心取樣，如果采取擠脫方式，不小心會造成實驗室地面及樣品污染，甚至污染到實驗員本身，導致實驗室整體污染。在加入陽性對照時，要在特定區域或空曠區域加入，加樣時要特別小心，避免灑落和槍頭的無害化處理，確保陽性對照不會污染實驗室或污染到其他樣本。

2.3.3實驗室合理分區

實驗室根據不同功能區可以分成試劑配制區、核酸提取區、核酸擴增區等三大區，有條件的豬場還可以增加物資儲備區、樣本處理區和廢棄物處理區等。正常區域應該配有傳遞窗（具有僅能單一打開的雙層門，含有紫外照射）方便樣品傳遞以及防止外界污染。各區域要控制好空氣流動，防止由于氣溶膠循環污染。

2.3.4實驗室日常消毒和監測

通常實驗室每天對臺面等區域進行清理清潔，并采用84消毒液進行日常消毒；通常情況下，操作臺、自動抽提機、實驗室各區域，每天操作結束后需要定時紫外消毒，包括每天晚上，定時照射紫外半小時以上；移液槍、離心機、PCR儀、抽提機等需要定期用84消毒液進行消毒，必要時需要廠家專業人員進行拆洗，如移液槍等設備；定期對實驗室人員、地面、操作臺、各處理間、儀器設備等進行采樣檢測評估（空氣沉降法和表面擦拭法），評估是否實驗室造成污染，如果出現污染，立即對實驗室進行消殺，確保實驗操作不受污染。

2.3.5實驗廢棄物處理

廢棄物包括豬場送樣的風險樣品（預處理前）、預處理過程中使用的槍頭/一次性手套等、抽取樣品和核酸以及陽性對照的槍頭、核酸提取反應板、擴增后產物等。這些物品通常需要高壓滅菌（121 ℃30 min）后再處理，也可以在合適區域，加入柴油等及時進行焚燒處理。應注意存在陽性風險的實驗廢棄物不得在空地長時間放置，要避免動物媒介將污染擴散，任何廢棄物建議第一時間處理或密封存放。

2.4 實驗室設備維護

2.4.1定期維護

實驗室移液槍需要定期維護好（包括定期廠家校準，正常半年一次；并且每天上下午實驗結束后要調至最大刻度，防止彈簧壓死，影響移液量），避免出現漏液、少液等情況，以免導致實驗結果不太精準。

2.4.2及時清理消毒

全自動抽提機和PCR儀需要及時清理、消毒，每次做完實驗后，及時定期進行紫外照射，長時間不用設備時，可以考慮及時將電源關閉，避免長時間待機不使用，影響使用年限。

2.4.3避免受潮及斷電保護

實驗室設備要進行適當合理分區擺放，設備放置區域要保住通風干燥，通常與冰箱以及清洗區適當分開，有利于避免設備受潮，而降低設備的使用壽命。貴重設備建議安裝設備斷電保護器，防止運行時斷電可能造成對設備的損壞情況等。

3 豬場非洲豬瘟采樣檢測過程的一些常見誤區

3.1 生物安全意識低

若采樣未成立專業采樣隊，采樣過程和消毒過程一樣，都可能會發生不小心導致疫情擴散的情況，若非專業隊操作，可能會導致陽性豬樣品擴散給其他豬只。并且在送樣過程中未對樣品進行固定擺放（樣品盒或紙板等），容易導致某個樣品溢出后污染全部樣品，導致檢測結果不準確。送樣過程未做到專人單向運輸，或者傳遞完樣品后又接著送生產物資等，可能造成全場交叉污染，對生物安全的威脅巨大。

3.2 豬場現場采樣不合理

3.2.1環境采樣不合理

注意消毒藥的影響，尤其是氯制劑、過氧乙酸等容易對核酸進行降解的消毒藥，若這類消毒藥對環境進行消毒后不得立即采樣，應注意藥物揮發后再采樣。另外若用戊二醛消毒，采樣檢測ASFV核酸也是沒有必要的。

3.2.2唾液樣品采集不到位

豬只咀嚼時間不足，或者未控水采樣，導致部分低毒量豬只無法檢出的情況，無法及時對陽性豬只進行清除，從而導致陽性豬只長期存在而傳染給周邊豬只或同棟其他區域豬只。

3.2.3異常豬采樣不確保

若無法采集到豬只唾液（不咀嚼棉簽或長時間未喝水導致口干），建議深部咽拭子采樣，若仍然采集不到，可以考慮采集血液或者豬頭能接觸的欄桿料槽等環境樣，確保盡可能收集到能準確評估豬只狀況的樣品。

3.3 實驗室操作不專業

3.3.1實驗員培訓不到位

實驗員對實驗操作不熟悉，可能導致加樣時混樣、串樣或者污染其他樣品，導致陽性樣本污染陰性樣本的情況，影響實驗結果。另外檢測過程中也需要防止各種污染，包括日常進出實驗室操作、日常消毒和監控以及污染物的無害化處理等措施。

3.3.2樣品合并檢測不合理

抗原檢測時，核酸混樣超過5個，這樣容易導致檢測結果不準確，如部分病毒量比較低的樣品可能會由于混樣導致檢測陰性。抗體混樣檢測會增加實驗操作，而且對出結果的時間也會大大降低。

3.3.3處理不當造成假陰性

實驗室或采樣人員處理樣品時，可能會存在樣品采集不足或運輸過程風干等情況，實驗員可能涉及到加入稀釋液或緩沖液將樣品進行稀釋，但如果檢測結果與實際偏差太大，容易導致生產一線對疫情暴發程度的誤判，容易導致現場制定錯誤的清除策略。

3.3.4實驗數據分析不準確

非專業人員，不會判斷儀器設備出現故障或者出現異常，則很容易導致誤判，影響到生產一線的下一步操作。

3.3.5儀器維護不及時

實驗室移液槍等未定期維護好（或日常未調節好刻度），可能存在漏液、少液等情況，影響到檢測結果，導致實驗結果不太精準；其他設備應定期清理清潔，并且電源要定時關閉，設備最好不要長時間處于待機狀態。

3.3.6使用低性價比的產品

實驗設備不穩定、試劑盒準確度和靈敏度不高，雖然價格上占優勢，但得出的結果和實際偏差很大，往往會導致豬場帶來嚴重的后果。建議選用高品質的實驗設備和試劑盒，配套全方位正確方案，才能讓豬場實際生產得到保障。

4 總結

我們知道，ASF疫情一直都是可防可控，即使變異病毒的出現算是雪上加霜，國內仍有大量規模化豬場“拔牙”成功，表明只要控制好生物安全、采樣檢測、豬群流動等一系列關鍵點，任何毒株造成的疫情都能成功穩定控制。我們堅信，在有效疫苗出現前的若干時間里，在國內規模化豬場采樣和檢測環節，若能做到人員操作行為專業、方法手段新穎好用、污染擴散控制有效、檢測分析精準可靠等一系列關鍵節點，一定能將ASFV拒之大門之外；哪怕有ASFV進入到豬場，也能借助科學手段做到精準快速清除，繼而實現豬場穩定生產。