非洲豬瘟疫苗研究的困境和展望

陳芳洲，楊華威，趙祖凱

（武漢天種畜牧有限責任公司，湖北 武漢 430344）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）于1921年首次被報道，是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬只急性、熱性、出血性、高度接觸性傳染病，臨床感染豬只的死亡率可以高達100%[1]。臨床上，ASF主要被分為3種類型：強毒力、中等毒力和低毒力類型[2]。強毒力類型的豬只主要引起發燒、食欲不振、精神萎靡、呼吸困難、皮膚充血、甚至死亡；低毒力毒株的ASFV可引起豬只間歇或者持續的病毒血癥，引起皮膚壞死和關節炎等[3]。根據ASFV的P72蛋白的B646L基因的序列，最少有24種基因型的ASFV毒株已經被鑒定。

1921年，ASF首先在非洲肯尼亞被報道，這也是其名字的由來。1921年，在東非肯尼亞首次確認ASF疫情。之后在非洲呈現地方流行，1957年首次傳入歐洲葡萄牙，1971年傳入美洲古巴，1978年傳播到意大利。2007年，首次傳播至歐亞接壤的格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆和俄羅斯，并在高加索地區呈現地方流行。2012年傳入烏克蘭，2013年傳入白俄羅斯。2014年傳入歐盟的立陶宛、波蘭、拉脫維亞、愛沙尼亞，2016年傳入摩爾多瓦，2017年傳入捷克，羅馬尼亞。2018年8月我國遼寧首次確診ASF疫情。我國流行的主要是基因II型的ASFV毒株，據文獻和行業的報道，我國豬場存在其他類型的ASFV毒株的流行。

針對ASF的滅活疫苗研制道路似乎走不通。從免疫保護的角度來說，減毒活疫苗的研制似乎是一條可行的道路，但是其潛在的散毒和在臨床中持續感染的風險，嚴重地影響其商品化進程。亞單位疫苗，特別是聯合多種亞單位進行聯合使用，重組活載體疫苗，DNA疫苗都顯示了一定的可行性，但是目前仍然都存在非常多的問題。復制缺陷單周期病毒這條道路解決了減毒活疫苗安全性的疑慮，是一條值得嘗試的ASF疫苗研發道路。

1 ASF疫苗研究的困難點

從1921年首次被報道，一百年以來，各國科學家不懈地探索ASF的疫苗研制。盡管很多不同類型的候選疫苗展示了一定的可行性。截至目前，還沒有任何一種商業化的ASF疫苗。

哪些因素限制了ASF疫苗的研制呢？

病原本身的特性：1）ASFV的基因組非常大，為170～193 kb，病毒粒子直徑約200 nm，編碼150～167個基因；2）這些基因與毒力及免疫相關的功能，以及多個基因之間協同互作的復雜情況還不太清楚；3）ASFV毒株變異性大，目前對其中和抗體的了解還不清晰，依據其VP72蛋白基因B646L，將其分為24個基因型；4）ASFV難以在體外培養系統穩定快速生長。

病原和宿主的互作：1）強毒ASFV常導致易感動物的快速死亡，因此很難研究病原和宿主相互作用關系；2）臨床常見緊急使用的滅活疫苗失效，導致疫情進一步的擴大；3）目前對ASFV感染后是否產生中和抗體還存在爭議；4）宿主的免疫保護機制還不明確，難以針對性地設計疫苗；5）不同毒株之間的交叉保護性差，ASFV基因型也多，候選疫苗的應用譜有限；6）缺乏良好的體外疫苗免疫效果評估動物模型；7）常見的減毒活疫苗免疫攻毒實驗的持續期較短，對候選減毒活疫苗的持續感染排毒，以及對豬只的副作用研究較少；8）疫苗的毒株匹配性、使用劑量、接種途徑、接種動物的特點等還未明確；9）未注冊非法減毒活疫苗的使用，在臨床容易轉變為慢性感染，導致臨床豬群副反應，嚴重危害行業，增加了大家對ASF疫苗安全性的擔憂。

2 ASF理想疫苗的標準

被報道一百年以來，尚未研制出合格的商業化疫苗；一些歐洲國家，例如西班牙，歷經了使用實驗性疫苗導致疫情進一步惡化，之后通過不使用疫苗，成功凈化了ASF，這也是目前OIE所提倡的方式；我國通過創造性的定點清除策略成功處置ASFV強毒株的案例；未注冊非法弱毒疫苗給臨床造成了巨大的損失，都讓我們思考：理想的ASF疫苗的關鍵點是什么？

1）安全性是第一位的 疫苗的安全包括對免疫豬只的個體，和通過垂直和水平傳播等對豬群的安全性；同時不僅是疫苗對豬只的健康的影響（持續感染和副作用等），也需要考慮疫苗對豬只種用質量、銷售價格、生產性能等方面的綜合影響；

2）有效性 包含對整個免疫豬群不同豬只的免疫保護性，同時需要考慮免疫譜，特別是針對異源毒株的免疫保護性；最好能具有同時激發體液免疫和細胞免疫的能力；

3）可區分免疫和感染狀態 區分豬群免疫還是感染狀態非常重要，可通過特異性的病原PCR或者抗體ELISA等方法對豬群感染情況進行區分；

4）在滿足GMP要求的高質量的疫苗制品廠生產 一方面能保證疫苗質量持續穩定生產，且能避免疫苗外排毒風險；另一方面，需要穩定的病毒體外培養系統，能低價穩定生產；

5）跨動物物種的疫苗適用性不僅要能用于家豬，如果能同時用于野豬等，有助于ASF防控的簡化。

3 不同類型ASF疫苗的研究現狀

3.1 滅活疫苗路線基本走不通

20世紀30年代，人們就開展了ASF滅活疫苗的研制。

20世紀里，豬只器官、器官分泌物、戊二醛固定的感染細胞等通過加熱和/或化學試劑滅活的方式，開展了ASF滅活疫苗的研制，結果是沒有保護、部分保護、不能保護異源毒株攻毒等情況。

2014年，Blome等人[4]，2021年，Cadenas-Fernández等人[5]，開展了類似的以BEI（二乙烯亞胺）滅活病毒之后加入不同佐劑的滅活疫苗的研制，這些實驗表明這些候選滅活疫苗甚至不能保護同源毒株對豬只的攻毒。因此，對ASF滅活疫苗的研制似乎走入了死胡同。

3.2 減毒活疫苗似乎是最有希望的，但其安全隱患引起了巨大的爭議

20世紀30年代人們就開展減毒活疫苗的研究。減毒活疫苗的種類主要分為3種：通過人工體外傳代的方式獲得的減毒活疫苗、臨床中發現的自然減毒活疫苗以及通過基因工程技術人工制備的減毒活疫苗。

3.2.1自然缺失弱毒疫苗的研究

2001年開始，很多科學研究中報道了能對同源強毒攻毒起到100%保護力的自然缺失減毒活疫苗，能引起免疫動物高水平的細胞免疫，同時副作用是體溫升高、皮膚潰爛、關節腫等。

2004年Boinas等報道了來源于蜱蟲的NH/P68毒株能對同源毒株的攻毒起到良好的保護作用或者延遲疾病的發生[6]。

2017年Gallardo等人報道了從拉脫維亞野豬中分離的自然缺失弱毒株Lv17/WB/Rie1能有效地保護家豬[7]。Barasona等人的后續報道中，該毒株經口服途徑能保護野豬，但是該研究中還有很多地方需要進一步的評估，比如安全性、給藥劑量、遺傳穩定性以及動物長期排毒的特征等[8]。

歐盟的VACDIVA （H2020 Gran ID：862874）項目中也正在評估第3種自然缺失減毒毒株的免疫保護力，同時配套了檢測免疫和感染狀態的試劑盒，這一項目呈現出一些希望，但還在繼續評估中。

3.2.2傳代減毒疫苗的研究

1957年第一次報道免疫了細胞傳代減毒的ASF疫苗可以部分保護經受同源毒株攻毒的豬只，但是因為幸存豬只少，使后續對抗體的特點研究和研制很困難[9]。

1963年，葡萄牙和西班牙的科學家使用不同傳代方式的減毒活疫苗進行免疫攻毒實驗，2個實驗的結果都表明，只能起到部分保護作用，死亡率是變化的，而且會引起一定的副反應，比如皮膚潰爛、神經或者肺部系統的損傷等。同時一些免疫動物持續帶毒，變成了這些弱毒株病毒的載體，并進行散毒。

細胞傳代減毒弱毒苗的研制在持續進行中，盡管這些疫苗也展現出一定的保護力，但是，2017年，Titov等也報道了這些毒株會引起康復豬只血液和器官中持續數周的排毒情況[10]。同時，即使抵御住攻毒的豬只，28 d后仍然可能表現出臨床癥狀，其安全穩定性值得持續關注。

3.2.3基因工程缺失疫苗的研究

伴隨著基因工程技術的不斷發展，針對ASF的基因缺失疫苗的研究非常多，成為21世紀以來主要的ASF疫苗研究方向。因為對于ASFV不同基因的毒力和免疫保護特性的研究還不太清晰，因此這些研究中嘗試了不同的缺失形式：不同基因的單缺失疫苗研制、雙基因或者多基因的聯合缺失等形式，這些疫苗候選毒株的保護力差異巨大，從17%到100%不同。基因缺失毒株表現出非常好的保護力潛質，我國的哈爾濱獸醫所研究團隊也報道了7基因缺失ASFV毒株在動物實驗中的良好免疫保護作用[11]。

但是伴隨著各種減毒活疫苗的應用，都有一個非常重要的安全性問題，就是減毒活疫苗可能會造成持續的感染情況，以及引起豬只的副作用，比如皮膚潰爛、關節炎，導致神經系統、呼吸系統的損傷等問題。

近來FAO和路透社也報道了未注冊非法弱毒苗引起臨床慢性感染情況，甚至導致急性感染，對生豬行業造成巨大的損失，為ASF疫苗的研制，特別是減毒活疫苗的研制蒙上了巨大的陰影。

3.3 亞單位疫苗的研制還有較長的路需要走

20世紀90年代，人們開展了不同類型的亞單位疫苗的研制，桿狀病毒表達系統為常用的表達系統。1995年，VP12蛋白，1998年VP54和VP30分別被用于表達亞單位疫苗的研制，不幸的是，這些實驗中候選的亞單位疫苗免疫豬只后，無法抵御致死劑量ASFV的攻毒。2001年開始，常見的VP30、VP54、VP72和CD2v等蛋白被單獨或者混合用于ASF的免疫；除了常見的桿狀病毒表達系統，哺乳細胞，病毒載體也用于ASFV的亞單位蛋白的表達。

ASF的免疫攻毒實驗結果表明，整體來說，目前亞單位疫苗不能保護豬只或者只能部分保護豬只，還有較長的道路需要走。

3.4 其他類型的疫苗研究還需要不斷探索

其他類型的ASF疫苗主要包含DNA疫苗和/或載體疫苗、復制缺陷單周期病毒等。

載體疫苗主要依托腺病毒系統和桿狀病毒系統，這些疫苗中都可以誘導產生抗體，但是只有少部分的候選疫苗表現出攻毒保護力，保護力從20%到100%不等。不同載體疫苗的混合使用可能是未來DNA疫苗和/或載體疫苗的一個重大研究方向。2020年，Goatley等報道了8種載體抗原混合候選疫苗能對于中等毒力ASF的攻毒提供100%的保護力[12]。

復制缺陷單周期病毒借助輔助細胞表達缺失的蛋白，相較于ASF減毒活疫苗解決了安全性問題或降低安全性風險。單周期病毒原位復制，但是不進行病毒組裝。該技術已經被用于裂谷熱病毒、流感病毒、藍舌病毒、腺病毒等病毒復制缺陷單周期病毒的研究，且被證明有一定的免疫原性和保護原性，不僅能引起體液免疫，也能引起細胞免疫。因為相對于減毒活疫苗的安全性，該疫苗研制策略可作為一種ASF疫苗研制的方向。同時復制缺陷基因的確定，能穩定生產的輔助表達細胞體系的構建，都是構建復制缺陷單基因病毒需要解決的關鍵問題。

4 我國非洲豬瘟的防控

目前看來，我國ASF防控是一場持久戰，且處于戰略相持階段。根據農業農村部的報告和行業信息，目前ASF在我國呈現地方流行性。全國各地也都在推進ASF“無疫小區”的建設和申報。

ASF給我國生豬產業帶來了極大的損失。同時，ASF疫情也深刻地促進了我國生豬產業的發展，特別是對人員團隊的建設，生物安全制度的深入人心，新的養殖防疫制度的升級，甚至是行業結構的深遠變革。

1）ASFV基因II型野毒株的臨床感染的防控 我國智慧的養豬人創造性地提出了精準剔除的豬場ASFV基因II型野毒株凈化方案，不僅在臨床中得到了廣泛有效的應用，而且得到了國際同行的認可和尊敬，我國養豬人已經從最開始的向國外學習ASF防控技術的“小學生”到現在有了非常大的提升，而且有很多的技術突破。

2）臨床弱毒株感染的防控 我國臨床中已經鑒定了不同類型的ASFV弱毒株，FAO和路透社也報道了臨床未注冊非法疫苗的使用。因為臨床假弱毒苗的復雜多樣性，無法早期發現假疫苗毒的感染，以及目前尚無有效的假疫苗毒感染的剔除方案。盡管，目前臨床上假疫苗毒案例占比不高（10%左右），但是對于因假疫苗毒感染的豬場可能是致命的，會導致整個豬場，甚至其關聯豬場的清場。行業中針對假疫苗毒株的防控也有一些好消息，就是部分假疫苗毒株感染的案例通過部分清群方法成功凈化，盡管群體損失也非常大，但這可能是養豬人能否成功防控住弱毒株的分水嶺。

5 非洲豬瘟疫苗研制的展望

ASF是當前危害世界養豬業最重要的豬病。其病原ASFV也幾乎是我們面對的最復雜的豬病病原。歷經一百年，其疫苗研制的道路仍十分艱巨。

第一，還需要加強對其病原，病原和宿主相互作用的研究，弄清楚其感染、繁殖、致病、免疫等方面的特點；

第二，需要加強對其疫苗的研制，盡管目前尚無商品化疫苗，但是一些疫苗已經展示了較好的免疫保護能力，盡管還存在一些安全隱患，因此，對于理想ASF疫苗的研制和追求還是非常有必要的；

第三，在當前尚無商品化疫苗，非洲豬瘟疫苗商品化時間表還不明確的情況下，我國創造性地開創了ASF野毒的定點清除技術的基礎上，未注冊非法疫苗造成了臨床嚴重損失，以及西班牙等國家通過OIE認可的無疫苗凈化策略的基礎上，我國更應堅定地執行ASF疫苗研究科學家說了算，先推進國家的ASF“無疫小區”的建設，再實現區域的ASF凈化，最終希望我國生豬產業能徹底地凈化ASF，盡管目前來看，還是任重道遠；

第四，非洲豬瘟對生豬產業帶來了“危”和“機”，伴隨生豬行情的急劇下降，目前生豬產業的高速發展也該降降溫了。此時正是潛心修煉內功，讓管理能力、生產能力、生產質量等追上生豬產業規模發展的步伐，盡快回歸到生豬產業本身的高質量穩步發展的道路上。