原發性失眠患者中醫證型與神經肽S受體基因rs324981多態性的相關性*

楊 軍，謝宇平，蘇曉艷，馬 薇，惠培林，周麗雅

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院睡眠醫學中心，甘肅 蘭州 730000）

失眠癥是患者對睡眠時間和（或）質量不滿足并影響日間功能的一種主觀體驗，其具體表現在睡眠-覺醒節律紊亂過程中睡眠時間及深度的不足[1]。我國失眠癥的發生率高達45.4%[2]。研究證實長期失眠會增加心腦血管疾病、高血壓、焦慮、抑郁、癡呆和免疫力低下等的風險[3-6]，并且也是導致工作、學習效率低下和工業事故的主要原因之一[7]。失眠癥按照病因分為繼發性失眠和原發性失眠（primary insomnia，PI），PI是指出現睡眠障礙（難以入睡和/或睡眠維持困難或睡眠后精力未恢復），病程至少持續1個月，并且引起具有臨床意義的煩惱或者社交、職業等心理社會功能的損害，排除由于其他睡眠與精神/心理障礙，以及軀體疾病、酒精或藥物等導致的失眠[8]。神經肽S（neuropeptide S，NPS）及神經肽S受體（neuropeptide S receptor，NPSR）是一種新發現的睡眠調節系統[9]，其中NPSR基因rs324981單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism,SNP）與人類睡眠習慣改變密切相關[10]，并且前期研究也發現NPSR基因rs324981可能參與了PI的調節[11]。目前有較多的研究發現疾病的中醫證型與基因存在一定的關聯，但尚缺乏NPSR基因rs324981多態性與PI患者中醫證型易感性的相關性研究，故本研究擬探討PI中醫證型與NPSR基因rs324981多態性的關系，旨在從微觀量化指標來評價PI中醫證型。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫診斷標準PI診斷符合《美國精神障礙診斷與統計手冊》第4版（DSM-4）[8]的診斷標準。

1.1.2 中醫診斷標準 根據《中藥新藥臨床研究指導原則》[12]、《中醫內科學》“不寐”[13]中的中醫辨證分型標準，辨證為肝郁化火證、痰熱內擾證、陰虛火旺證、心脾兩虛證、心虛膽怯證。

1.2 納入標準（1）符合PI西醫診斷標準；（2）年齡18～65歲；（3）中國人群；（4）志愿并簽署知情同意書。

1.3 排除標準（1）其他睡眠或精神障礙及酒精、藥物等醫學問題引起的繼發性失眠，尤其是焦慮障礙引起的失眠；（2）高血壓、心臟病、甲狀腺功能障礙、糖尿病、腫瘤等疾病患者；（3）有其他明確的失眠原因，如近期有重大心理應激而致失眠者；（4）妊娠、哺乳期婦女；（5）多導睡眠圖（PSG）監測結果為主觀失眠；（6）PSG監測結果顯示呼吸暫停-低通氣指數（AHI）>5；（7）無法判斷中醫證型及資料不全者。

1.4 研究對象本研究方案經甘肅省人民醫院倫理委員會批準（編號：sy1120150043），所有受試者均簽署書面知情同意。納入2016年12月至2019年7月就診于甘肅省人民醫院睡眠醫學中心的失眠，為PI組。共收集PI患者154例，男48例，女106例，年齡18～65歲。中醫辨證：肝郁化火證47例（30.52%），痰熱內擾證16例（10.39%），陰虛火旺證60例（38.96%），心脾兩虛證24例（15.58%），心虛膽怯證7例（4.55%）。匹配130名健康者為對照組，來源于甘肅省人民醫院體檢中心招募的人群，選擇年齡、性別、體質量指數（BMI）等與PI組相匹配的健康人群，并保證兩組間患者無血緣關系。共收集健康人群130名，其中男42名，女88名，年齡18～65歲。

1.5 觀察指標

1.5.1 匹茲堡睡眠質量指數（PSQI）評分[14]根據PSQI評分進行睡眠質量分級，分別為睡眠質量好（≤5分），睡眠質量一般（6～11分），睡眠質量較差（12～16分），睡眠質量很差（17～21分）。

1.5.2 基因分型 采集受試者空腹肘靜脈血，取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血2 mL，將其轉移至-70℃的低溫冰箱凍存以待提取DNA。采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術有限公司），按照其操作步驟提取基因組DNA。采用NanoDrop2000分光光度計檢測DNA的濃度與純度，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質檢合格，-20℃儲存備用。采用AssayDesigner 3.1軟件進行引物設計，引物由北京博淼生物科技有限公司合成。rs324981引物序列如下，上游引物：ACGT TGGATGCATACCTGCAAATAGCGGAC，下游引物：ACGTTGG ATGCAGGACTGGTCAACATCTTG。使用美國Agena平臺，采用MassARRAYSNP 4.0基因分型實驗技術，進行基因多態性位點的基因分型檢測。PCR擴增反應:反應總體積為5μL含有10ng/μL的模板DNA（1 μL），Primer Mix（1 μL），H2O（1.85 μL），Hot-StarTaq（0.1 μL），MgCl2（0.325 μL），dNTP Mix（0.100 μL），PCR Buffer with 15 mmol/L MgCl2（0.625 μL）。PCR擴增條件:94℃預變性5 min，94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，變性、退火、延伸3個程序共進行45個循環,最后在72℃下延伸3 min后得到PCR產物。

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。運用哈溫平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）檢測驗證對照組遺傳平衡，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 基線資料及HWE檢驗PI組與對照組性別、年齡、BMI比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。（見表1）

表1 基線資料

應用網絡在線工具SNP Stats進行NPSR基因rs324981多態性基因型分布頻率的HWE檢測。結果顯示，對照組NPSR基因rs324981（P=0.878）基因型分布頻率符合HWE條件，具有良好的群體代表性。

2.2 PI患者中醫證型與NPSR基因rs324981多態性基因型和等位基因之間的關系陰虛火旺證患者NPSR基因rs324981多態性基因型分布與對照組比較，差異有統計學意義[P=0.034，OR=2.10，95%CI（1.05，4.19）]，但兩者等位基因分布比較，差異無統計學意義（P>0.05）；其他各中醫證型NPSR基因rs324981多態性的基因型和等位基因分布分別與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；PI患者各中醫證型基因型和等位基因分布兩兩比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。（見表2）

表2 不同中醫證型的NPSR基因rs324981多態性與對照組比較[n(%)]

2.3 虛證、實證PI患者基因分布與對照組比較實證（肝郁化火證、痰熱內擾證）PI患者和虛證（心脾兩虛證、心虛膽怯證、陰虛火旺證）PI患者NPSR基因rs324981多態性基因型和等位基因分別與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；實證與虛證基因型和等位基因比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。（見表3）

表3 虛證、實證PI患者基因分布與對照組比較[n(%)]

2.4 NPSR基因rs324981多態性與睡眠質量水平的關系PI患者不同睡眠質量人群NPSR基因rs324981多態性的基因型、等位基因分布比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表4）

表4 NPSR基因rs324981多態性與睡眠質量的關系[n(%)]

3 討 論

NPSR基因rs324981是7號染色體p14.3區NPSR基因第107個三聯密碼中A/T突變。研究表明[15]，NPSR基因rs324981的A/T突變導致了活性中心的受體結合位點一個氨基酸發生改變（天冬氨酸→異亮氨酸），使NPS敏感性增大了約10倍。另外，NPSR基因rs324981的T基因型可能會導致睡眠潛伏期延長及睡眠持續時間縮短[16-17]，并且NPSR基因rs324981中TT純合基因型人群比攜帶A基因型人群睡眠時間顯著縮短[17]，而前期研究也發現攜帶NPSR基因rs324981的T基因型較正常人群更易患PI。

PI屬于中醫學“不寐”范疇，其病因主要與飲食、情志、勞倦及年老體虛等因素相關，病機總屬陽盛陰衰，陰陽失交。中醫對于疾病的治療以辨證為基礎，而“證”是中醫理論的核心。有學者對“證”與基因多態性的相關性進行了探究，認為兩者之間存在必然的聯系[18-19]。基因組學研究從整體水平上反映了疾病發展過程中不同階段基因隨時空變化表達的動態演變過程，而中醫學的“證”則為不同階段病因病機的高度概括,并且中醫學的“證”與基因遺傳多態性都具有“個體化”的特點，可見兩者之間有著共同的物質基礎，而這種物質基礎很有可能反映在基因或基因組水平上。因此，基因檢測技術可應用于探索中醫證型分類的微觀分子基礎。目前已有較多學者在高血壓、冠心病、腦卒中、腫瘤等疾病中醫證型與基因多態性相關性方面作了有益探索。胡霖霖等[20]研究發現，失眠障礙患者的中醫證型與5-HTTLPR/5-HTTVNTR基因多態性分布相關。本研究發現NPSR基因rs324981多態性表達水平在PI各中醫證型及對照組中均有表達。PI陰虛火旺證患者NPSR基因rs324981多態性基因型分布與對照組比較，差異有統計學意義[P＜0.05，OR=2.10，95%CI（1.05，-4.19）]。154例PI患者中陰虛火旺證患者占多數，這一結果可能與該證型患者年齡較大有關，年齡為（51.97±6.73）歲，高于其他證型（P＜0.05）。PI失眠陰虛火旺證患者的病因病機為久病和/或年老致患者體內津液虧虛，陽不交陰、陰虛不斂而陰陽失交，臟腑功能紊亂、陰虛火旺擾亂心神故而失眠。而PI排除由于其他睡眠與精神/心理障礙，以及軀體疾病、酒精或藥物等導致的失眠，因此陰虛火旺證較好地反映了PI的病因病機。NPS-NPSR是一種新發現的系統，目前該領域的研究主要以動物研究為主，而臨床研究較少，并且與中醫證型易感性的研究更是空白，因此本研究結果缺乏對比。

NPS-NPSR系統促覺醒作用明顯，主要表現為延長睡眠潛伏期，減少覺醒向慢波睡眠的轉換次數，增加覺醒時間，縮短慢波睡眠和快速眼動睡眠時間[21-22]。不同睡眠質量的失眠患者所對應的睡眠特征存在差異，而不同睡眠特征所構成的中醫證型也存在差異。本研究通過對PI患者PSQI量表的評估，分析NPSR基因rs324981多態性突變是否與睡眠質量存在相關性。結果表明，不同睡眠質量患者所攜帶的NPSR基因rs324981多態性的基因型、等位基因分布差異無統計學意義（P>0.05）。因此，NPSR基因rs324981多態性可能未參與睡眠質量的調節。NPSR基因rs324981多態性是否與睡眠結構參數存在相關性，還需通過多導睡眠監測參數進一步分析。

綜上所述，易感基因NPSR基因rs324981多態性表達水平可能影響PI患者陰虛火旺證的發生。但本研究也存在研究樣本量較小、缺乏對比研究等缺陷。因此，未來需要在大樣量的基礎上增加更多NPSR多態性位點，以便更加清晰地揭示NPSR基因多態性與PI中醫證型易感性的關系，以促進PI中醫證候的客觀化和標準化發展，為以后PI患者提供更加精準的治療策略。