益腎養(yǎng)卵方對早發(fā)性卵巢功能不全患者卵巢儲備功能、卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2/Bax的表達(dá)及PI3K/AKT信號通路的影響*

張 慧，李雯雯，張建濤

（1.北京航空總醫(yī)院，北京 100022；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

卵巢功能會隨著女性年齡增大不斷衰退，通常女性月經(jīng)停止年齡在50.7歲左右[1]，但部分女性在40歲之前出現(xiàn)繼發(fā)性閉經(jīng)，伴低雌激素、促性腺激素升高等，即早發(fā)性卵巢功能不全（POI）[2]。POI發(fā)生率為1%～5%，且近年來呈現(xiàn)出低齡化的趨勢[3]。當(dāng)前，POI的致病機制尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其與醫(yī)源性損傷、免疫、遺傳等因素有密切關(guān)聯(lián)[4]。越來越多研究指出：卵巢顆粒細(xì)胞自噬可能與POI的發(fā)生與進(jìn)展有密切關(guān)聯(lián)[5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病機在于腎虛血瘀，以致邪盛正衰，久而促成POI[6]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路介導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞自噬引起POI有一定相關(guān)性。本次研究旨在觀察益腎養(yǎng)卵方治療POI療效，并分析其對PI3K/AKT信號通路的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《早發(fā)性卵巢功能不全的臨床診療中國專家共識》[7]與《婦產(chǎn)科學(xué)》[8]擬定POI臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜40歲；（2）月經(jīng)紊亂（閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)）超過4個月；（3）連續(xù)2次（間隔4～6周）血清促卵泡生成素（FSH）＞25 mIU/mL，雌激素波動性下降。

1.1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《中醫(yī)婦科學(xué)》[9]擬定POI中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。主癥：月經(jīng)提前或推后，量少色淡紅（深紅），或月經(jīng)停閉。次癥：腰膝酸軟，形體消瘦，潮熱盜汗，肢麻耳鳴，失眠健忘等，舌紅，苔少，脈細(xì)緩。具備主癥與至少2項次癥，結(jié)合舌脈即可診斷。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）年齡＜40歲的育齡期女性；（2）符合POI中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）近3個月內(nèi)未接受相關(guān)治療；（4）同意參與本次研究，并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）輸卵管不通、先天性性腺發(fā)育不全、生殖道畸形等器質(zhì)性疾病者；（2）合并內(nèi)分泌疾病或嚴(yán)重心肝腎原發(fā)性疾病者；（3）年齡≥40歲；（4）依從性較差，無法配合治療者。

1.4 研究對象選取2019年1月至2020年3月在北京航空總醫(yī)院中醫(yī)門診及婦科接受治療的POI患者120例，采用隨機數(shù)字表法將患者分為對照組與治療組，每組60例。本次研究經(jīng)北京航空總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意進(jìn)行，研究過程遵守相關(guān)倫理學(xué)要求，倫理學(xué)審批號：201900152。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 患者于月經(jīng)周期第5天起服用雌二醇地屈孕酮片[Abbott Biologicals B.V.（荷蘭），批準(zhǔn)文號：H20150345，規(guī)格：2 mg/片]進(jìn)行治療，1粒/次，1次/d，餐后0.5 h口服。停藥后若未出現(xiàn)月經(jīng)來潮，則在停藥7 d后繼續(xù)服藥治療，若月經(jīng)來潮，則在第5天開始重復(fù)使用。

1.5.2 治療組 在對照組基礎(chǔ)上加用益腎養(yǎng)卵方治療，方藥組成：熟地黃20 g，鹿角膠、菟絲子、女貞子、山藥、枸杞子各15 g，丹參、山萸肉、淫羊藿、覆盆子各10 g，陳皮、砂仁各6 g。1劑/d，加清水煎煮，取300 mL水煎液早晚分服。

兩組均以3個月經(jīng)周期記為1個療程。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 中醫(yī)證候積分 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[10]并結(jié)合患者具體癥狀表現(xiàn)進(jìn)行評分，主癥按照癥狀嚴(yán)重程度無、輕度、中度、重度分別計0、2、4、6分，次癥按照癥狀嚴(yán)重程度無、輕度、中度、重度分別計0、1、2、3分，評分越高提示癥狀越嚴(yán)重。

1.6.2 卵巢儲備功能 患者月經(jīng)周期第3～5天，清晨空腹抽取5 mL肘靜脈血，室溫下靜置1～2 h，離心（3 000 r/min，15 min），取血清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清抗苗勒管激素（AMH）水平（試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，批號：ARB10908），化學(xué)發(fā)光免疫法檢測血清FSH、雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）水平（上海滬震實業(yè)有限公司，F(xiàn)SH試劑盒批號：hz-H0760c，E2試劑盒批號：hz-0022c；LH試劑盒批號：hz-H0115c），并計算FSH/LH值；通過陰道超聲檢查測定卵巢直徑，并計算卵巢總體積TOV（TOV=最大長寬高直徑乘積×π/6）；測定竇卵細(xì)胞數(shù)量（AFC）。

1.6.3 卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)因子（Bcl-2/Bax）、PI3K/Akt信號通路表達(dá)水平 蛋白印跡法檢測卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2/Bax與子宮前后壁PI3K/Akt信號通路表達(dá)水平，冰浴條件下加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白并測定濃度。取50 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離后轉(zhuǎn)至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，4℃孵育過夜。一抗37℃孵育3 h，二抗37℃孵育1 h，采用Image Lab軟件進(jìn)行分析處理。

1.7 療效標(biāo)準(zhǔn)參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[10]擬定POI療效標(biāo)準(zhǔn)，痊愈：臨床癥狀、體征均完全消失，經(jīng)期正常，不孕者妊娠或療效指數(shù)≥95%；顯效：臨床癥狀、體征顯著改善，經(jīng)期恢復(fù)（28±7）d，療效指數(shù)≥70%，＜95%；有效：臨床癥狀、體征減輕，經(jīng)期、經(jīng)量改善，療效指數(shù)≥30%，＜70%；無效：未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。療效指數(shù)=[（治療前中醫(yī)證候積分-治療后中醫(yī)證候積分）/治療前中醫(yī)證候積分]×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法研究數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。療效采用秩和檢驗；中醫(yī)證候積分、卵巢儲備功能指標(biāo)、Bcl-2、Bax、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達(dá)等計量資料采用（±s）表示并進(jìn)行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料兩組患者基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。（見表1）

表1 兩組患者基線資料比較（±s）

表1 兩組患者基線資料比較（±s）

組別 例數(shù) 年齡（歲） 病程（年）Kupperman評分（分）對照組60 35.17±2.26 3.24±0.87 15.28±3.37治療組60 35.21±2.35 3.18±0.79 15.32±3.64 t 0.095 0.395 0.062 P 0.924 0.693 0.950

2.2 兩組患者療效比較治療組治療總有效率88.33%（53/60）高于對照組的70.00%（42/60）。治療組患者療效顯著優(yōu)于對照組（P＜0.05）。（見表2）

表2 兩組患者療效比較[例（%）]

2.3 兩組患者中醫(yī)證候積分比較與治療前比較，兩組患者治療后中醫(yī)證候積分均顯著降低（P＜0.05），且治療后治療組患者中醫(yī)證候積分顯著低于對照組（P＜0.05）。（見表3）

表3 兩組患者中醫(yī)證候積分比較（±s，分）

表3 兩組患者中醫(yī)證候積分比較（±s，分）

組別 例數(shù) 治療前 治療后 t P對照組 60 44.92±13.48 35.84±12.16 3.874 0.000治療組 60 44.87±14.53 24.61±11.94 8.345 0.000 t 0.020 5.104 P 0.984 0.000

2.4 兩組患者卵巢儲備功能指標(biāo)比較與治療前比較，兩組患者治療后AMH、E2、AFC均顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH、FSH/LH均顯著下降（P＜0.05）；治療后治療組患者AMH高于對照組，F(xiàn)SH、FSH/LH均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組患者治療前后TOV比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 兩組患者卵巢儲備功能指標(biāo)比（±s）

表4 兩組患者卵巢儲備功能指標(biāo)比（±s）

AMH（ng/mL） FSH（mIU/mL） E2（pmol/L） LH（mIU/mL）治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 0.61±0.42 0.95±0.53 3.895 0.000 30.51±3.39 16.37±5.18 17.692 0.000 93.64±18.37 104.28±12.72 3.689 0.000 9.76±1.34 7.08±2.45 7.434 0.000治療組60 0.58±0.39 1.14±0.48 7.014 0.000 30.67±3.58 13.27±4.94 22.092 0.000 91.86±22.53 107.35±14.81 4.450 0.000 9.83±1.47 6.46±2.21 9.835 0.000 t 0.405 2.058 0.251 3.355 0.474 1.218 0.273 1.456 P 0.686 0.042 0.802 0.001 0.636 0.226 0.786 0.148 AFC（個） TOV（cm3） FSH/LH治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 2.78±1.2 3.94±2.03 3.802 0.000 5.54±3.62 6.18±2.94 1.063 0.290 3.12±0.18 2.27±0.29 19.290 0.000治療組60 2.59±1.17 4.63±2.27 6.188 0.000 5.63±3.858 6.31±3.24 1.047 0.297 3.15±0.24 2.02±0.21 27.447 0.000 t 0.874 1.755 0.132 0.230 0.775 5.408 P 0.384 0.082 0.895 0.818 0.440 0.000組別 例數(shù)組別 例數(shù)

2.5 兩組患者卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號通路表達(dá)水平比較與治療前比較，兩組患者治療后Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）；治療后治療組患者Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均高于對照組，Bax蛋白表達(dá)低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表5、圖1）

表5 兩組患者卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號通路表達(dá)水平比較（±s）

表5 兩組患者卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號通路表達(dá)水平比較（±s）

Bcl-2/β-actin Bax/β-actin治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 0.33±0.12 0.51±0.22 5.538 0.000 0.64±0.17 0.53±0.24 2.897 0.004治療組60 0.34±0.16 0.62±0.17 9.290 0.000 0.62±0.21 0.45±0.18 4.761 0.000 t 0.387 3.065 0.573 2.066 P 0.699 0.003 0.567 0.041 p-PI3K/β-actin p-Akt/β-actin治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 0.43±0.06 0.52±0.09 6.445 0.000 0.44±0.05 0.48±0.08 3.284 0.001治療組60 0.45±0.08 0.59±0.13 7.104 0.000 0.43±0.06 0.57±0.11 8.655 0.000 t 1.549 3.429 0.992 5.125 P 0.124 0.001 0.323 0.000 Bcl-2/Bax治療前 治療后 t P對照組60 0.52±0.03 0.95±0.06 49.652 0.000治療組60 0.51±0.03 1.23±0.17 32.307 0.000 t 1.826 12.031 P 0.070 0.000組別 例數(shù)組別 例數(shù)組別 例數(shù)

圖1 兩組患者子宮內(nèi)膜p-PI3K/p-AKT蛋白表達(dá)電泳條帶圖

3 討 論

自噬是真核細(xì)胞特有的自我降解機制，即通過溶酶體途徑降解受損的細(xì)胞器或長壽命蛋白質(zhì)，是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)必須的機制。一般情況下，自噬維持在正常水平以保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等不良刺激均可引起自噬水平的變化，自噬水平異常上調(diào)可引起細(xì)胞凋亡，卵巢顆粒細(xì)胞自噬導(dǎo)致卵泡細(xì)胞過早過快鎖閉可能是引起POI的主要原因之一[11]。自噬是由相關(guān)信號通路與自噬基因調(diào)控的，其中PI3K/AKT信號通路與卵巢顆粒細(xì)胞自噬關(guān)系最為密切。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基（p85）與催化亞基（p110）構(gòu)成的異源二聚體，酪氨酸激酶受體可與p85相結(jié)合，同時解除對p110的抑制，使其與p85羧基端相結(jié)合，并促進(jìn)二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿崃字＜〈迹≒IP3）激活A(yù)kt。之后Akt構(gòu)象變化并磷酸化，p-Akt作用于下游凋亡相關(guān)蛋白并調(diào)節(jié)自噬水平[12]。Bcl-2、Bax是調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的重要因子，二者互為拮抗作用，Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2活性下降會促進(jìn)細(xì)胞凋亡；反之Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Bax活性下降則抑制細(xì)胞凋亡[13]。壓力、缺氧、饑餓等應(yīng)激狀態(tài)會抑制Akt活化，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，引起細(xì)胞凋亡。白俊等[14]研究指出，卡鉑可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞自噬。王文靜等[15]研究指出，補腎養(yǎng)精顆粒可以增加p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，上調(diào)下游Bcl-2蛋白表達(dá)水平并抑制Bax表達(dá)，從而抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡?？梢奝I3K/AKT信號通路與卵泡鎖閉有密切關(guān)聯(lián)。

自噬參與了細(xì)胞增殖、分化、能量調(diào)節(jié)等諸多生理過程，過度自噬降解細(xì)胞生存所必須的成分并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與中醫(yī)學(xué)中“邪之所湊，其氣必虛”理念大致相同[6]。疾病可以看做是機體邪氣與正氣斗爭的過程，通常情況下機體處于陰陽平衡狀態(tài)，應(yīng)激狀態(tài)下機體正氣不足，PI3K/AKT通路受到抑制，無法調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞自噬過程，繼而引起卵泡鎖閉，引發(fā)POI。POI在中醫(yī)學(xué)中屬于“不孕癥”“閉經(jīng)”“月經(jīng)過少”等范疇?！稖?zé)岱暝础吩疲骸靶爸跏?，蓋以腎氣先虛，故邪乃湊之而伏于少陰”，指出了腎精充盛對抵抗外邪入侵的重要作用。《婦人歸》云：“婦人所重在血……胎孕乃成”，說明氣血條暢、腎精充盛是胎孕順利的根本?！毒霸廊珪吩疲骸澳I乃精血之?！保I藏精，主生殖。若腎氣虛虧，則生殖之精無所養(yǎng)，女性無法正常排卵，則月經(jīng)失調(diào)。故治療POI需補腎益沖，經(jīng)水自通，胎孕乃成。黎慧[16]研究指出，自擬排卵湯聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮片可以調(diào)控PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)患者激素水平，促使排卵恢復(fù)。李鳳英等[17]指出，溫腎助陽調(diào)周法可以通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路，改善患者性激素水平，促進(jìn)卵巢功能恢復(fù)。上述研究均證實補腎中藥可調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，從而改善患者卵巢功能。本研究選用的益腎養(yǎng)卵方由左歸丸化裁而成，方中熟地黃滋陰補血，鹿角膠益精養(yǎng)血，菟絲子滋補肝腎，女貞子補益腎陰，山藥補中益氣，枸杞子滋補肝腎，山茱萸補腎益氣，淫羊藿補腎壯陽，覆盆子固精補腎。女性易因疾病而緊張焦慮以致氣血不通，故佐以丹參清熱活血，陳皮燥濕化痰，砂仁行氣調(diào)中。全方滋補腎陰，溫補腎陽，同時通調(diào)氣血，健脾養(yǎng)肝?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究指出，鹿角膠可改善微循環(huán)，調(diào)節(jié)性激素水平；覆盆子可促進(jìn)排卵；熟地黃可促進(jìn)卵泡成熟；山茱萸有助于調(diào)節(jié)性激素分泌。綜上，本方可調(diào)節(jié)月經(jīng)周期，改善卵巢功能。

當(dāng)前，AMH、FSH、AFC、E2、TOV是臨床上評估卵巢儲備功能的重要指標(biāo)。其中，血清AMH水平不隨月經(jīng)周期發(fā)生波動，具有一定的穩(wěn)定性，此外血清AMH能夠反映卵泡發(fā)育成竇狀卵泡的水平。觀察AMH即可判斷卵巢內(nèi)是否存有卵泡，是評估卵泡數(shù)量的唯一潛在標(biāo)志，也是反映卵巢儲備功能的理想指標(biāo)[18]。AFC是指卵巢內(nèi)直徑2～9 mm的小卵泡，其與女性卵巢儲備功能呈正相關(guān)性。FSH/LH是反映卵巢功能的重要指標(biāo)，F(xiàn)SH/LH＞2～3.6提示卵巢儲備功能不良[19]。本研究結(jié)果表明，與治療前比較，兩組患者治療后卵巢儲備功能指標(biāo)AMH、E2、AFC均顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH、FSH/LH均顯著下降（P＜0.05），提示兩種治療方法均能改善POI患者卵巢儲備功能。治療后，治療組患者AMH高于對照組（P＜0.05），F(xiàn)SH、FSH/LH低于對照組（P＜0.05），結(jié)合兩組患者臨床療效與中醫(yī)證候積分提示益腎養(yǎng)卵方治療POI效果更佳。益腎養(yǎng)卵方治療POI的主要作用機制在于調(diào)控PI3K/AKT信號通路，并調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的比值，該比值越大，說明抗凋亡能力越強[20]。治療后，兩組患者p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），提示PI3K/AKT信號通路被激活，并調(diào)控下游Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。治療后兩組患者Bcl-2、Bcl-2/Bax均顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），且治療組患者Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均高于對照組（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)低于對照組（P＜0.05），提示益腎養(yǎng)卵方可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，抑制卵巢顆粒細(xì)胞過度自噬，減少細(xì)胞凋亡，從而改善POI患者疾病癥狀，提高卵巢儲備功能。

綜上所述，益腎養(yǎng)卵方可以調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，上調(diào)Bcl-2并抑制Bax蛋白表達(dá)，避免卵巢顆粒細(xì)胞過度自噬，從而減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，提高患者卵巢儲備功能。