復方板藍根顆粒標準研究與產(chǎn)品評價*

李 柯，戚建中，符國成，陳海剛，楊一棟，陳 丹

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；2.華潤三九（郴州）制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院，湖南 湘潭 411102）

復方板藍根顆粒是由板藍根和大青葉兩種中藥材組成的中藥成方制劑，功能為清熱解毒，涼血。臨床用于溫病發(fā)熱、出斑、風熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎、肝炎、腮腺炎等。

本品質(zhì)量標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》（中藥成方制劑第十二冊，WS3-B-2377-97）[1]，由于歷史的原因，制藥工藝粗放，質(zhì)控技術(shù)落后，過程風險控制薄弱，這些因素制約了本品發(fā)展。經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查證，全國共有150家生產(chǎn)企業(yè)有本品批準文號，真正銷售過億元的廠家不多，各企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量差別較大[2-3]?；谂R床需要“好藥”，產(chǎn)業(yè)需要“大藥”的理念，促進其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，筆者前期進行了制備工藝研究，變更了藥品處方中已有藥用要求的輔料；改變影響藥品質(zhì)量的生產(chǎn)工藝[4]。在工藝變更的基礎(chǔ)上，本研究以小試、中試及工藝驗證21批產(chǎn)品為樣本，以精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸和靛玉紅為指標性成分，建立薄層色譜鑒別方法；以尿苷、鳥苷和腺苷為指標性成分，建立高效液相色譜含量測定方法并確定了三者總含量的限度。經(jīng)方法學驗證，所建立的質(zhì)量標準可以控制本品的質(zhì)量。

1 材 料

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XS204電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥復方板藍根顆粒[批號：1804001N，1804002N，1804003N，華潤三九（郴州）制藥有限公司]，大青葉（批號：190301，產(chǎn)地：甘肅）購自郴州凱程醫(yī)藥有限公司，板藍根（批號：20190201，產(chǎn)地：黑龍江）購自安徽省亳州市醫(yī)藥供銷有限公司，兩味藥材經(jīng)檢驗均符合2015年版《中華人民共和國藥典》第一部藥材標準。鳥苷對照品（批號：111977-201501，含量93.6%），尿苷對照品（批號：110887-201803，含量99.5%），腺苷對照品（批號：110879-200202，含量100%），R,S-告依春對照品（批號：111753-201706，含量100%），以上對照品均購自中國食品藥品檢驗研究院；甲醇[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，色譜級]；其他試劑均為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1氨基酸的薄層鑒別 取本品2 g，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。取板藍根對照藥材0.5 g，加乙醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。另取L-脯氨酸、精氨酸、亮氨酸對照品，分別加乙醇制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。另外，根據(jù)處方比例分別稱取缺板藍根、缺大青葉藥材制成缺板藍根、缺大青葉的陰性溶液。照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020年版四部（通則0502）試驗，吸取對照藥材溶液1 μL，對照品溶液1 μL，供試品溶液與陰性溶液2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品和缺大青葉陰性樣品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，缺板藍根陰性樣品無精氨酸對照品斑點，說明精氨酸屬于板藍根專屬性成分。（見圖1）

圖1 復方板藍根顆粒中氨基酸的薄層色譜圖

2.1.2 靛玉紅的薄層鑒別[5]取本品30 g，研細，加水50 mL溶解，再加50 mL三氯甲烷，加熱回流1 h后，取三氯甲烷層溶液，濃縮至1 mL作為供試品溶液。另取靛玉紅對照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對照品溶液。按照薄層色譜法《中華人民共和國藥典》2020年版四部（通則0502）試驗，吸取對照藥材溶液5μL，對照品溶液5μL，供試品溶液10～15μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶1）為展開劑，展開取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。（見圖2）

圖2 復方板藍根顆粒中靛玉紅的薄層色譜圖

2.2 成分的含量測定[6-8]

2.2.1 色譜條件Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動相A，以水為流動相B，梯度洗脫（0～3 min，2%A；3～16 min，2%→5%A；16～20 min，5%→8%A；20～30 min，8%A；30～35 min，8%→20%A；35～42 min，20%→90%A；42～48 min，90%A；48～50 min，90%→2%A；50～60 min，2%A）；檢測波長為245 nm，流速為0.8 mL/min；柱溫為25℃，進樣體積5 μL，理論塔板數(shù)按尿苷峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春各20 μg及腺苷25 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）10 min使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。2

.2.4陰性對照溶液 按復方板藍根顆粒處方和制備工藝制備缺板藍根的陰性樣品、缺大青葉的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法分別制成缺板藍根、缺大青葉的陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。（見圖3）

圖3 復方板藍根顆粒HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察取尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷對照品貯備液各1 mL，分別稀釋2、5、10、20、50倍，制備成一系列不同濃度的對照品溶液。進樣5 μL，測定，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行回歸分析，尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的回歸方程分別為：Y=97.475-0.000、Y=162.308X-0.005、Y=505.581X-0.052、Y=138.411X-0.005。r值均為1.000，結(jié)果表明尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的濃度分別0.004～0.209、0.002～0.102、0.0008～0.0420、0.001～0.061μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗取同一份均勻供試品溶液（批號：1804001N），按照測定法連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算各指標峰面積的相對標準偏差，結(jié)果尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的RSD分別為0.3%、0.2%、0.9%、0.2%，表明本方法儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗精密稱取已研細的本品（批號：1804001N）1.5 g，按照供試品溶液的制備方法制備，取供試品溶液分別于0、6、16、24、32、38、46、56、64 h分別進樣5 μL，記錄色譜峰面積，計算相對標準偏差。結(jié)果尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的RSD值分別為1.7%、1.1%、1.9%、2.1%，表明4個成分在64 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復性試驗取同批號已研細的本品（批號：1804001N）1.5 g，精密稱定，按照供試品溶液的制備方法制備樣品，一式6份，按色譜條件進行測定，進樣5 μL，記錄色譜圖，計算含量和相對標準偏差，結(jié)果尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春、腺苷的含量 分 別 為0.26、0.14、0.06、0.08 mg/g，RSD值 分 別 為2.2%、0.6%、0.9%、2.3%，表明本方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗取已知含量的本品（批號：1804001N）0.75 g，一式6份，分別加入同一濃度（相當于100%濃度水平）的尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春及腺苷混合對照品溶液后，按照供試品溶液的制備方法制備，平行制備6份供試品。按照測定法測定，計算回收率（%）及其相對標準偏差（RSD）。結(jié)果見表1～4。

表1 尿苷準確度試驗測定結(jié)果

表2 鳥苷準確度試驗測定結(jié)果

表3 （R,S）-告依春準確度試驗測定結(jié)果

表4 腺苷準確度試驗測定結(jié)果

2.8 樣品含量測定及限度的確定

2.8.1 不同批次樣品含量測定及指標成分的選定 按擬定的方法，分別對21批次復方板藍根顆粒[999R華潤三九（郴州）制藥有限公司]進行含量測定，結(jié)果表明尿苷、鳥苷、腺苷穩(wěn)定，（R，S）-告依春穩(wěn)定性不好，不適宜作為含量測定指標。（見表5）

表5 21批次顆粒尿苷+鳥苷+腺苷總含量及（R,S）-告依春含量結(jié)果

2.8.2 不同廠家樣品含量測定及限度的確定 購買了市場上銷量較大的17個廠家共32批次的復方板藍根顆粒，以尿苷、鳥苷、腺苷總量為測定指標進行測定，結(jié)果表明各個廠家尿苷、鳥苷、腺苷總含量差異較大，含有量限度按照平均值（4.40 mg/袋）下浮30%計算，建議規(guī)定本品每袋含板藍根以尿苷、鳥苷、腺苷總量計不得少于3.0 mg。（見表6）

表6 不同廠家復方板藍根尿苷、鳥苷、腺苷總含量測定結(jié)果

續(xù)表6：

3 討 論

板藍根藥材含量控制成分為（R,S）-告依春，且屬于板藍根特征性成分，但文獻報道該成分極不穩(wěn)定，無論在藥材、各類制劑中含量穩(wěn)定性均極差[9-10]，這與工藝驗證3批復方板藍根顆粒穩(wěn)定性研究結(jié)果吻合，且按單位含量計（mg/g）在本品中含量低于萬分之二，不適合選擇將其作為含量質(zhì)控成分；另板藍根顆粒與復方板藍根顆粒處方組成類似，工藝均為水提醇沉，2019年8月國家藥典委員會最新公示的板藍根顆粒中已取消（R,S）-告依春的測定，鑒于此，暫不考慮將（R,S）-告依春作為本品含量測定的指標性成分，同時鑒于3個成分化學結(jié)構(gòu)相似，均屬于核苷類成分，參照板藍根顆粒最新公示稿標準，以3個成分總量作為本品含量限度控制標準。

對市售32批復方板藍根顆粒中尿苷、鳥苷、腺苷的總量測定，結(jié)果表明差異較大[2-3,11]，建議生產(chǎn)企業(yè)建立從藥材、中間體和成品的質(zhì)量控制體系，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。