一測多評法同時測定血府逐瘀膠囊中7種成分的含量*

鄭 正，付 鵬

（北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

血府逐瘀膠囊源于清代醫家王清任的《醫林改錯》血府逐瘀湯[1]，是由11味中藥，即炒桃仁、紅花、赤芍、川芎、麩炒枳殼、柴胡、桔梗、當歸、地黃、牛膝和甘草，在中醫基礎理論指導下，按照中藥劑型工藝制備而成的中藥復方制劑。該制劑具有活血祛瘀、行氣止痛的功效，廣泛用于臨床上的瘀血內阻所致胸痛、頭痛、失眠多夢、心悸怔忡、內熱瞀悶、急躁善怒等癥[2]。現代藥理研究表明，制劑中的芍藥苷通過調控L型電壓依賴型鈣通道顯著改善經前煩躁障礙癥肝氣郁結大鼠的抑郁情緒，橙皮苷可通過減少神經細胞凋亡和調控GR、NR2B的表達發揮抗抑郁作用[3-4]；柚皮苷能夠抑制關節炎（CIA）大鼠炎癥反應從而對類風濕關節炎有保護作用[5]；蕓香柚皮苷是一種具有抗過敏活性的黃酮類化合物[6]；新橙皮苷對糖脂代謝有一定的調節作用[7]；甘草苷能夠有效清除氧自由基，甘草酸對治療乙型肝炎病毒、艾滋病毒方面具有良好的效果[8-11]。該制劑的質量易受藥材來源、等級、提取工藝等因素的影響而波動，而目前《國家藥品監督管理局標準》WS3-B3049-98對血府逐瘀膠囊的質量控制為采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中芍藥苷的含量，并規定每粒膠囊中含芍藥苷不得低于0.24 mg[12-13]。中藥發揮療效的固有特性是多組分、多靶點協同作用，而僅靠控制單一的中藥有效成分群的含量，難以客觀、全面地評價產品的質量。因此，有必要建立一種簡單、方便、實用、可綜合評價該制劑的質量控制方法。

一測多評法是指通過藥物組分間的某種內在函數關系，建立內參物和各成分間的相對校正因子，從而實現多種有效成分含量同時測定的一種快速評價手段，該評價手段已在中藥飲片及其復方制劑的質量控制中廣泛應用[14-15]。本研究遵循質量標志物確認的原則，選取血府逐瘀膠囊中赤芍的代表成分芍藥苷，枳殼所含主要活性成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷，甘草所含主要成分甘草苷、甘草酸銨為檢測指標。其中芍藥苷為內參物，采用一測多評法同時測定該制劑中的7種有效活性成分，為血府逐瘀膠囊質量標準的提高與完善提供實驗參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器HPLC色譜儀（美國安捷倫公司，Agilent 1200型），主要包括UV紫外檢測器，四元梯度泵和Empower Pro色譜工作站；自動純水機（美國，Milli Pore Advantage A10）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200 DE型）；電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司，XS205DU型）。

1.2 藥物與試劑對照品分別為：芍藥苷（批號：110736-201337，純度為95.7%）、新橙皮苷（批號：110727-201608，純度為99.9%）、柚皮苷（批號：110722-201613，純度為94.3%）、橙皮苷（批號：110721-201310，純度為96.1%）、甘草苷（批號：111610-200604，純度為98.0%）、甘草酸銨（批號：110731-201619，純度為93.0%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號：180901，純度為98.0%）來源于成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈和磷酸（色譜級）來源于默克公司，其他試劑（分析純）來源于天津化學試劑廠，水為屈臣氏蒸餾水。5批血府逐瘀膠囊（批號分別：20190721，20190810，20190920，20191002，20191028，20191125，0.4g/粒）為天津宏仁堂藥業有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱為Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序為：0～12 min，17% A；12～18 min，17%→20% A；18～23 min，20%→28% A；23～36 min，28%→45% A；36～44 min，45%→70% A；44～50 min，70%→95% A；檢測波長：220nm；柱溫：30℃，流速：0.8mL/min；進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取1.45 mg的芍藥苷、1.237 mg的柚皮苷、0.840 mg的橙皮苷、1.56 mg的新橙皮苷、1.14 mg的蕓香橙皮苷、1.88 mg的甘草苷、0.678 mg的甘草酸銨對照品，分別置于7個25 mL的透明容量瓶中，滴加50%的甲醇超聲溶解后定容至刻度線，制成各自質量濃度為55.51、46.66、32.29、62.34、44.69、73.70、25.22 μg/mL的對照品貯備溶液。

2.3 供試品溶液的制備取血府逐瘀膠囊樣品約0.2 g，精密稱定樣品質量，置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密量取25 mL的50%甲醇溶液，緩慢加入后稱定總質量，超聲波提取目標成分40 min后，取出，放冷后再稱重，補足減失的甲醇溶液質量，搖勻，微孔濾膜0.45 μm過濾，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照品溶液的制備缺少赤芍藥材的陰性對照樣品、缺少麩炒枳殼藥材的陰性對照樣品和缺少甘草藥材的陰性對照樣品均在中醫基礎理論的指導下，參照血府逐瘀膠囊用藥比例和制備工藝分別制備完成，最后再按“2.3”項下方法制備各陰性對照溶液。

2.5 方法學考察已制備好的混合對照品溶液和供試品溶液各精密吸取10 μL，按照既定的HPLC-UV進樣程序設置進樣，最后記錄50 min的HPLC色譜圖（見圖1）。結果顯示，芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的色譜峰分離度均≥1.5，理論塔板數按照各成分色譜峰計算均≥3 500，陰性樣品對含量測定無干擾。表明所建立的HPLC-UV方法滿足本次實驗的測試要求

圖1 對照品與樣品HPLC色譜圖

2.6 線性關系、定量限和檢出限精密量取0.25、0.50、1.25、2.50、5.0 mL的芍藥苷（濃度為55.51 μg/mL）、柚皮苷（濃度為46.66μg·mL-1）、橙皮苷（濃度為32.29μg·mL-1）、新橙皮苷（濃度為62.34μg·mL-1）、蕓香橙皮苷（濃度為44.69 μg·mL-1）、甘草苷（濃度為73.70 μg·mL-1）、甘草酸銨（濃度為25.22 μg·mL-1）混合對照品溶液，置于透明的容量瓶中，緩慢滴加甲醇溶液定容至5 mL的刻度線處，即可稀釋配制成不同質量濃度的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷和甘草酸銨對照品溶液，然后依次按照既定的HPLC-UV色譜條件進樣10 μL定量分析，根據峰面積（A）計算各個成分的含有量。即7種成分的質量（X，μg）為橫坐標，其各自的峰面積積分值（Y）為縱坐標，通過計算得出各自標準曲線的回歸方程與相關系數r。結果見表1，表明各成分的線性關系在其相應的質量濃度范圍內均有良好的線性關系。以3倍的信噪比（S/N=3）得出儀器檢出限和10倍的信噪比（S/N=10）得出儀器的定量限。

表1 7種化學成分線性關系

2.7 精密度試驗取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品1份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法，連續測定6次后計算各成分的含量。結果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的含有量RSD值分別為：1.20%、1.03%、1.02%、1.05%、0.95%、1.03%、0.98%，表明本次實驗儀器的精密度良好。

2.8 穩定性試驗取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品1份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法，分別于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色譜儀。結果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種有效成分的峰面積（A）的RSD值分別為：1.05%、1.12%、1.33%、0.84%、0.73%、1.02%、0.98%，表明樣品溶液中的7種成分在12 h內均有良好的穩定性。

2.9 重復性試驗取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品共6份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進樣方法，分別進樣分析。結果芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的含有量RSD值分別為：1.01%、1.22%、1.21%、0.99%、0.95%、1.35%、0.98%，表明建立的方法重復性較好。

2.10 加樣回收率試驗取同一批次的血府逐瘀膠囊樣品共9份，每份取約0.1 g，精密稱定后分別置于錐形瓶100 mL中，每組分別加入芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨對照品溶液，加入的量為血府逐瘀膠囊樣品中各成分含量的50%、100%和150%，按照已定的樣品制備和HPLC-UV程序進樣方法進行色譜分析，并計算7種有效成分的加樣回收率。結果顯示，平均回收率分別是芍藥苷為99.88%（RSD=1.12%）；柚皮苷為101.80%（RSD=1.10%）；橙皮苷為105.07%（RSD=0.53%）；新橙皮苷為98.98%（RSD=1.21%）；蕓香橙皮苷為101.22%（RSD=1.23%）；甘草苷為100.99%（RSD=1.31%）；甘草酸銨為98.79%（RSD=1.02%），本次實驗的加樣回收率良好，表明建立的實驗方法準確、可靠。

2.11 建立一測多評（QASM）法的質量評價模式

2.11.1 計算相對校正因子（fi/s） 精密量取“2.6”項下配制的一系列混合對照品溶液，按照HPLC-PDA程序進樣的方法依次進樣測定芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的峰面積，以芍藥苷為內參物，用濃度與峰面積之比計算校正因子，將待測成分與內參物校正因子之比計算fi/s，計算公式為fi/s=AsCi/AiCs，式中As為內參物峰面積，Cs為內參物濃度，Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分濃度。計算柚皮苷（f1）、橙皮苷（f2）、新橙皮苷（f3）、蕓香橙皮苷（f4）、甘草苷（f5）、甘草酸銨（f6）的fi/s分別為1.80、1.08、0.82、0.78、0.57、0.52。

2.11.2 fi/s的耐用性考察 本次實驗對不同人員、流速、柱溫、色譜柱和HPLC儀器對fi/s的影響進行了考察：分別選用了Agilent 1260色譜儀和Waters 2695色譜儀系統；Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；3種不同的流速；3種不同柱溫；2名研究人員進行了耐用性考察。結果表明各因素對fi/s無顯著影響，RSD值在0.48%～1.87%（見表2），表明重現性良好、方法可行，因此可采用一測多評法進行血府逐瘀膠囊的含量測定。

表2 各種因素對fi/s的影響

2.12 樣品含量測定及比較為了進一步驗證所建立的一測多評法的準確性，本研究采用外標法和一測多評法的fi/s對5批血府逐瘀膠囊中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的含量進行測定，并進行比較分析。結果顯示，一測多評法與外標法測定結果的相對誤差（RD）小于2%，無明顯差異，表明所建立的一測多評法可以用于血府逐瘀膠囊的質量評價研究（見表3）。

表3 5批血府逐瘀膠囊7種指標成分含量測定結果（mg/粒）

3 討 論

3.1 測定指標成分的選擇血府逐瘀膠囊是在中醫基礎理論指導下，經過中藥藥劑制備工藝精心制備而成的中藥復方，該方中各有效成分協同作用、共同發揮藥效。2015年版《中華人民共和國藥典》中規定芍藥苷和柚皮苷為血府逐瘀膠囊的指標成分，筆者結合該復方的藥理實驗結果，選擇可能發揮療效的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種化學成分為測定指標，采用一測多評-HPLC法同時定量分析了各有效成分在樣品中的含有量，結果顯示，7種有效成分在已定的HPLC色譜方法下分離度均較好。

3.2 波長的選擇本次實驗筆者通過全波長掃描發現，在波長220 nm處芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨均有明顯的吸收，故實驗選擇在波長220 nm下對芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種有效成分的含量進行測定。

3.3 HPLC條件優化實驗過程中分別對乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水3種流動相系統進行了對比，發現在乙腈-0.05%磷酸水流動相體系下進行梯度洗脫時，芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨7種成分之間色譜峰的分離度均大于1.5，分離效果較好；考察不同的溫度（29、30、31℃）和不同的流速（0.7、0.8、0.9 mL·min-1）對各有效成分色譜峰的分離效果，結果發現30℃的柱溫、0.8 mL·min-1的流速可以達到色譜峰基線平穩、分離度和峰形較好的效果；考察不同品牌的4種色譜柱Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；Waters XBridgeTM C18（4.6mm×250mm，5 μm）；Thermo BDS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），結果發現Agilent TC-C18柱能將7種成分，即芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的色譜峰分開，并達到良好的分離度。通過對耐用性的考察，結果顯示不同品牌的色譜柱、不同的HPLC檢測儀器和不同的實驗人員操作對相對校正因子（f）的影響均不顯著，并且在不同條件下，7種有效指標性成分的f重現性較好（RSD＜2.0%）。

3.4 樣品提取方法的選擇通過單因素考察的方式對血府逐瘀膠囊樣品的提取溶劑、提取方法等進行考察。考察了甲醇、50%甲醇，70%甲醇；加熱回流、浸提和超聲提取；提取30、40、50 min對芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨提取效果的影響，結果發現50%的甲醇超聲提取40 min即可使該制劑樣品中的芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨提取完全。

3.5 小結本研究建立了一測多評-HPLC法同時測定血府逐瘀膠囊中芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蕓香橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨含量的方法，對5批血府逐瘀膠囊中7種成分進行了外標法和一測多評法定量分析，結果表明兩種方法測定的成分含量差異較小。通過對HPLC分離參數進行了一系列的方法學考察，優化得出最理想的HPLC色譜分離方法，表明本次實驗所建立的一測多評方法能同時測定血府逐瘀膠囊中7種有效成分的含有量，結果較為準確、快速。本研究不僅能夠科學客觀的評價血府逐瘀膠囊內在質量，同時又能節約對照品、提高檢測速度、降低成本，便于應用于該制劑生產過程中的質量控制。