UPLC法同時測定紅景天及其市場流通品4種成分的含量*

徐智瑋，李亞偉，吳立斌，李永鵬，賈守寧，宋 霞，劉亞蓉，陳文娟，竇 萱

（1.青海省中醫院，青海 西寧 810000；2.青海藥品檢驗檢測院，青海 西寧 810016）

紅景天作為雪域高原圣藥，以其獨特的生長環境和顯著的藥效而著稱。紅景天始載于《四部醫典》[1]，藏藥經典著作《晶珠本草》對其功效進行了詳細的描述，言“紅景天活血清肺、止咳退燒、止痛，用于治療肺炎、氣管炎、身體虛弱、全身乏力、胸悶、難于透氣、嘴唇和手心發紫”[2]。《中華人民共和國藥典》2020年版中規定紅景天正品基源為大花紅景天Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根莖，具有益氣活血、通脈平喘功效，用于氣虛血瘀、胸痹心痛、中風偏癱、倦怠氣喘[3]。隨著紅景天藥用價值的不斷挖掘，目前連花清瘟膠囊為主的中成藥制劑，不僅在國內防治新型冠狀病毒肺炎上發揮作用，更是加快了踏上國際舞臺的腳步[4]。紅景天作為組方中的重要一味藥，現面臨著紅景天藥材基原混亂[5-6]和正品大花紅景天原生環境遭到破壞[7-8]等諸多制約紅景天產業發展的問題。基于全國第四次中藥資源普查成果，實驗考察了正品大花紅景天、市場流通品小花紅景天、地標品狹葉紅景天及習用品唐古紅景天，通過超高效液相色譜（UPLC）法測定紅景天主要成分紅景天苷及其苷元酪醇、沒食子酸和咖啡酸的含量后進行分析，為紅景天藥材的質量評價、生產加工及擴大藥源提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器美國WATERS（Acquity-uplc）超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（PDA）；ACE Excei 2 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 um）；AE200電子天平（梅特勒）；XS105DU分析天平（梅特勒）；超聲清洗器（科橋）。

1.2 試劑乙腈（色譜純，Merck公司）；50%甲醇（自配）；磷酸（分析純）；超純水（Millipore公司）。沒食子酸（批號：110831-201805，純度＞98%）、紅景天苷（批號：110818-201804，純度＞98%）、咖啡酸（批號：110831-201805，純度＞99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；酪醇（批號：110818-201804，純度＞98%）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 藥材收集的19批紅景天藥材部分采于資源普查中，全部經青海省中醫院中藥基礎研究所趙國福主任鑒定為正品：大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba，習用品狹葉紅景天R.kirilowii（Regel）Maxim.，習用品唐古紅景天R.tangutica（Maximowicz）S.H.Fu，代用品市售品小花紅景天基原名為長鞭紅景天R.fastigiata（Hook.f.et Thoms.）S.H.Fu。（見表1）

表1 19批不同來源紅景天藥材信息表

續表1：

2 實驗方法

2.1 色譜條件色譜柱為ACE Excei 2 C18柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流速為0.4 mL/min，柱溫為30℃，進樣體積為5 μL，檢測波長為275 nm；流動相A為0.1%的磷酸超純水溶液,流動相B為乙腈溶液，分析時間為15 min。梯度洗脫程序如下：0～1 min（96%A），1～3 min（90%A），3～15 min（96%A）。

2.2 供試品溶液制備精密稱取不同品種、不同批次的紅景天粉末1 g，置100 mL錐形瓶中，加50%甲醇100 mL，20℃超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，靜置室溫，濾過，濾液先過微孔濾膜（0.45 μm），然后過微孔濾膜（0.25 μm），取續濾液作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液制備分別精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品3.55 mg、紅景天苷對照品2.05 mg、酪醇對照品4.21 mg和咖啡酸1.25 mg分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為對照品儲備溶液，用時各精密量取1 mL混合即得對照品溶液。在該色譜條件下，各成分峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數以沒食子酸峰計應不低于4 000，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品及供試品UPLC圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果表明4個化合物在其線性范圍內線性關系良好。取“2.3”項下混合對照品溶液用甲醇逐級稀釋后進樣測定，按（S/N=10）、（S/N=3）分別計算定量限（LOQ）和檢出限（LOD），結果見表2。

表2 各成分回歸方程與線性關系

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸峰面積的RSD分別為0.40%、0.59%、0.75%、0.34%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批大花紅景天樣品（大花S1），按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣同一供試品溶液，分別計算4種化合物峰面積的RSD值。結果顯示沒食子酸RSD為0.42%、紅景天苷RSD為0.60%、酪醇RSD為0.78%、咖啡酸RSD為0.34%，可見樣品在24 h內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品S1，按照“2.2”項下方法平行提取6份，在優化的色譜分析條件下連續進樣，計算4種化合物峰面積的RSD值。結果沒食子酸RSD為2.1%、紅景天苷RSD為4.2%、酪醇RSD為3.01%、咖啡酸RSD為2.35%，RSD值均小于5%，表明其重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批大花紅景天供試品（大花S1），按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行取樣6次，分別加入各單一對照品儲備溶液適量，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液并測定，并按照公式計算各個化學成分的平均回收率。（見表3）

表3 紅景天中4種化學成分的加樣回收率試驗結果（n=6）

2.4.6 紅景天中4種化學成分的含量測定 精密稱定19批不同批次紅景天藥材粉末，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣分析，圖2為供試品溶液與混合對照品溶液的高效液相色譜圖（波長為275 nm）。根據上述標準曲線及線性范圍所得的回歸方程計算不同批次供試品溶液中4種化學成分的含量，結果見表4。

表4 不同批次紅景天中4種化學成分的含量測定結果（mg/g，n=3）

圖2 不同批次紅景天中4種化學成分的分析結果（n=3)

3 結果及分析

3.1 制備條件與優化

3.1.1 提取紅景天溶劑篩選 本實驗考察了蒸餾水、乙醇、甲醇作為溶劑提取紅景天中的化合物，紅景天含有大量的多糖物質，用溶劑水和乙醇提取，提取液比較黏稠，不宜過分子膜，且進樣后各個峰之間分離度差，雜峰較多。故最終選擇甲醇作為紅景天藥材提取溶液。在此基礎上，對同一條件下30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇進行考察，結果發現用50%甲醇提取出峰較多，且峰形較好。最終確定以50%甲醇為溶劑制備紅景天藥材供試品溶液。

3.1.2 制備方法與優化 本實驗考察了超聲提取法和加熱回流法的提取工藝，發現加熱回流法提取費時費力，提取的有效成分含量比超聲提取法低。同時發現在室溫25℃，超聲1 h效果好。

3.1.3 色譜條件的篩選與優化 本實驗考察了不同的流動相系統如甲醇-水、乙腈-水對提取工藝的影響，發現乙腈-水系統梯度調整效果好。同時本實驗紅景天的主要有效成分紅景天苷和主要成分沒食子酸均為酚類化合物，顯酸性，故在流動相中加入一定量的酸以抑制酚羥基離子化，結果表明分離效果明顯提高。在酸的種類的選擇上，比較了甲酸、磷酸和冰醋酸溶液，分離效果甲酸＞磷酸＞冰醋酸；但是甲酸作為有機酸，酸性明顯強于磷酸，使用時間長容易腐蝕色譜柱，故選擇流動相乙腈-磷酸水。同時也考察了在超純水中加入（0.05%、0.10%、0.20%）的磷酸、柱溫（30、35、40℃）及流速（0.3、0.4、0.5 mL/min）。最終結果表明，流動相為0.10%的磷酸水-乙腈溶液、流速為0.4 mL/min，柱溫為30℃時對紅景天藥材經行梯度洗脫，基線平穩、各化合物之間分離度高且峰形較好。

3.2 含量測定結果相關性分析

3.2.1 紅景天苷與酪醇之間存在相互轉化 筆者測定14批紅景天藥材中，供試品S3、S6、S9、S14、S15至少存放了兩年以上，供試品S1、S4、S10、S11至少存放了一年以上，而S2、S5、S7、S8、S12均為當年采收。結合表4數據可以得知紅景天苷的含量隨著時間的增長而遞減，且供試品S3與S6相比其他中酪醇含量較高。由此可以得出紅景天苷及其苷元酪醇之間存在相互轉化，紅景天苷隨長時間的存放水解轉化為酪醇。（見圖3）

圖3 儲存時間影響紅景天有效成分含量

3.2.2 紅景天根莖生長年限影響紅景天苷的含量 筆者測定15批紅景天藥材中，供試品S13的紅景天苷含量在檢測線之下，在采挖供試品S13中發現其根部已腐朽嚴重；發現5年生的紅景天藥材中紅景天苷含量均高于同品系下的紅景天。分析原因可能在于野外生長的紅景天，其藥用根莖生長年限一般5年左右適合采收，而超過5年以上的生長期的根莖往往容易腐朽，其藥用成分紅景天苷的含量會降低。以后規模化種植紅景天采收季節可選在5年左右。（見圖4）

圖4 生長年限影響紅景天有效成分含量

3.2.3 紅景天采收部位影響紅景天苷的含量 本文測定5批唐古紅景天藥材中，只有供試品S9、S10與S11紅景天苷含量低于2015版《中華人民共和國藥典》規定的0.5%，分析原因在于S9、S10、S11采挖于山坡石縫中，一般以采集地上根莖較多；而S7采挖于溪邊，較容易采集到它的根。原因分析可能在于紅景天根的紅景天苷含量會高于根莖。

3.2.4 小花紅景天中紅景天苷含量基本在檢測線以下 本實驗測定4批小花紅景天藥材中，發現小花紅景天顯效物質紅景天苷含量基本在檢測線之下，而沒食子酸含量高于其他幾種紅景天。

4 小 結

本實驗考察不同的流動相系統進行梯度洗脫，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等溶劑系統。結果以流動相為0.1%的磷酸水-乙腈溶液、流速為0.4 mL/min，柱溫為30℃時對紅景天藥材經行梯度洗脫，基線平穩、各化合物之間分離度高。最終通過對PDA檢測器下的圖譜進行觀察，275 nm處紅景天沒食子酸、紅景天苷、酪醇、咖啡酸均顯示出較強的響應值，且4個色譜峰峰型好，最終選擇275 nm為檢測波長。整個方法簡單，便于操作和控制成本。而且實驗使用UPLC法能大大縮短了檢測時間，該方法10 min內就完成紅景天4種化合物的檢測工作，比傳統高效液相色譜（HPLC）檢測時間縮短了0.5～1.0 h，符合現代化中藥檢測要求。

近些年來大花紅景天5 000 m以上的自然環境不斷遭受破壞，當地政府也相繼出臺了保護政策，使大花紅景天的價格不斷攀升而市場卻依然供不應求。目前甘肅、四川省已將狹葉紅景天這一藥用品種納入地方現行藥材標準中，目前是唯一栽培成功的品種，栽培種植年限可考慮在5年左右。而唐古紅景天用藥歷史已有千年，本實驗中4種成分含量與大花紅景天近似，紅景天苷含量也僅次于大花紅景天，可建議作為大花紅景天的新藥源；而長鞭紅景天根莖以其形似大花紅景天，且具有相當豐富的蘊藏量，被稱為小花紅景天。現作為大花紅景天的代用品大量流入市場、藥店和藥廠，但是實驗結果顯示其主要成分紅景天苷基本在檢測線下，應繼續深入研究。