基于層次分析法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選陳皮麻黃飲水提工藝*

譚娥玉，王賢兒，林信亨，馬少鋒，關(guān)琴笑，唐興榮

（江門(mén)市五邑中醫(yī)院，廣東 江門(mén) 529000）

陳皮麻黃飲是名中醫(yī)唐興榮在臨床上實(shí)踐多年的驗(yàn)方，該方由二陳湯和三子養(yǎng)親湯加減化裁而成，由陳皮、苦杏仁、紫蘇子、桔梗、麻黃、干姜、甘草、五味子、金蕎麥9味中藥組成，具有溫肺化飲、止咳平喘的功效，主要用于日久不愈的咳嗽諸證，現(xiàn)擬將其制備為合劑。為確保制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性及有效性，本實(shí)驗(yàn)以苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸及總黃酮含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用層次分析法（AHP）確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選陳皮麻黃飲的水提工藝，為進(jìn)一步完善該制劑的制備工藝提供可靠依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料陳皮、苦杏仁、紫蘇子、桔梗、麻黃、干姜、甘草、五味子、金蕎麥飲片均購(gòu)自廣州市集芝寶中藥有限公司，經(jīng)我院藥學(xué)部李燕暉副主任中藥師鑒定為正品；橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19030701，純度：98.46%）、苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19042820，純度：99.28%）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19053107，純度：99.02%）、甘草酸單銨鹽對(duì)照品（批號(hào)：MUST-16113011，純度：99.10%）（成都曼思特生物科技有限公司）；磷酸為分析純，水為超純水，甲醇為色譜純。

1.2 儀器1260 InfinityⅡ型HPLC儀[美國(guó)Agilent公司，包括四元泵（G7111A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G7129A）、柱溫箱（G7129A）、DAD檢測(cè)器（G7117C）、色譜工作站（OpenLAB CDS Chem－Station）]；WH-800型超聲波清洗機(jī)（濟(jì)寧萬(wàn)和超聲電子設(shè)備有限公司）；HH-3A型數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋（金壇市精達(dá)儀器制造有限公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；T6型紫外可見(jiàn)光-分光光度計(jì)（北京普析通用有限責(zé)任公司）；Best-S30型超純水機(jī)（芷昂儀器上海有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定陳皮麻黃飲中苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脫：0.00～5.00 min，10%A，5.01～6.00 min，10%～18%A，6.01～16.00 min，18%A，16.01～17.00 min，18%～20%A，17.01～32.00 min，20%A，32.01～33.00 min，20%～50%A，33.01～45.00 min，50%A，45.01～50.00 min，10%A。檢測(cè)波長(zhǎng)：苦杏仁苷207nm，0～16min；橙皮苷283 nm，16～25 min；迷迭香酸330 nm，25～30 min；甘草酸250nm，35～50min。流速：1.0mL/min；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液配制

2.1.2.1 對(duì)照品貯備液配制 精密稱(chēng)取苦杏仁苷16.55 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3.31 mg苦杏仁苷的貯備液；精密稱(chēng)取橙皮苷16.40 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3.28 mg橙皮苷的貯備液；精密稱(chēng)取迷迭香酸4.41 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.441 mg迷迭香酸的貯備液；精密稱(chēng)取甘草酸單銨鹽9.34 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1.868 mg甘草酸單銨鹽的貯備液。

2.1.2.2 混合對(duì)照品溶液配制 分別精密量取苦杏仁苷貯備液4 mL、橙皮苷貯備液2 mL、迷迭香酸貯備液1 mL、甘草酸單銨鹽貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含苦杏仁苷1.324 0 mg、橙皮苷0.656 0 mg、迷迭香酸0.044 1 mg、甘草酸單銨鹽0.186 8 mg的混合對(duì)照品溶液。（甘草酸質(zhì)量=甘草酸單銨鹽質(zhì)量/1.020 7）

2.1.3 供試品溶液配制 精密量取陳皮麻黃飲水提液20 mL，水浴蒸干，加甲醇20 mL超聲30 min，轉(zhuǎn)移至20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照品溶液配制 取缺少苦杏仁、陳皮、紫蘇子、甘草的陰性對(duì)照樣品，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，見(jiàn)圖1。由圖1可知，供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有相同的色譜峰，且陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，說(shuō)明該方法可行。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 將混合對(duì)照溶液稀釋為系列對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸計(jì)算，即得苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍。結(jié)果表明4種指標(biāo)成分在各自含量范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。（見(jiàn)表1）

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，以峰面積指標(biāo)計(jì)算RSD（n=5）。結(jié)果顯示苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽峰面積的RSD分別為0.92%、1.02%、1.03%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、24 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單胺鹽峰面積RSD，RSD分別為1.02%、1.05%、1.23%、2.69%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一水提液適量，按“2.1.3”平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，同時(shí)測(cè)定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽的峰面積，計(jì)算其峰面積RSD，RSD分別為0.94%、0.45%、0.67%、2.16%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的供試品溶液10 mL，共6份，分別置于20 mL量瓶中，分別精密加入各對(duì)照品溶液，加水定容至刻度，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽峰面積，由回歸方程計(jì)算，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽平均加樣回收率分別為95.32%、96.64%、96.09%、95.87%，其RSD分別為4.63%、3.05%、4.89%、2.80%，均小于5%。

2.2 紫外-分光光度法（UV）測(cè)定陳皮麻黃飲中總黃酮的含量

2.2.1 供試品溶液的制備 取20 mL濃縮水提液置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后加入20 mL甲醇，超聲30 min，置于20 mL容量瓶中，定容，得甲醇提取液。精密吸取甲醇提取液1 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)量橙皮苷對(duì)照品7.03 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻，即得0.351 5 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 顯色劑的配制 稱(chēng)取ZrOCl2·8H2O固體2 g置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成2%ZrOCl2·8H2O甲醇溶液。

2.2.4 測(cè)定方法及波長(zhǎng)的選擇 參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，準(zhǔn)確吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各1 mL，置于20 mL容量瓶中，分別加入1 mL 2% ZrOCl2·8H2O甲醇溶液進(jìn)行顯色，再加入甲醇定容至刻度，搖勻。用2% ZrOCl2·8H2O甲醇溶液作為空白對(duì)照，放置15 min后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果顯色的供試品溶液、對(duì)照品溶液在313 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇總黃酮的測(cè)定波長(zhǎng)為313 nm。

圖2 全波段掃描光譜圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 取0.351 5 mg/mL對(duì)照品溶液0.6、0.8、1、1.2、1.4 mL分別置于20 mL容量瓶中，加入1 mL 2%ZrOCl2·8H2O甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。在313 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在0.021 09～0.049 21 mg/mL范圍內(nèi)具良好線(xiàn)性，回歸方程y=15.092x+0.011 1，R2=0.999 6。

2.3 層次分析法（AHP）確定各考察指標(biāo)的權(quán)重系數(shù) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]，根據(jù)本方的配伍特點(diǎn)、各藥材的實(shí)際配比及藥理作用強(qiáng)弱，采用AHP法將橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸、總黃酮含量這5個(gè)指標(biāo)的重要程度予以量化，確定各指標(biāo)優(yōu)先順序：橙皮苷＞苦杏仁苷=迷迭香酸＞甘草酸＞總黃酮，具體判斷矩陣見(jiàn)表2。采用幾何平均法計(jì)算得橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸、總黃酮含量權(quán)重系數(shù)分別為0.449 8、0.193 7、0.193 7、0.105 0、0.057 7，隨機(jī)一致性比率（CR）＜0.1，說(shuō)明指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣滿(mǎn)足一致性要求，權(quán)重系數(shù)有效、可行。

表2 各指標(biāo)5個(gè)層次的優(yōu)先矩陣

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化水提工藝

2.4.1 水提工藝 稱(chēng)取處方量1/10藥材，置于500 mL具塞三角燒瓶，加適量純水，浸漬30 min后，加熱煮沸，調(diào)至慢火，靜置，抽濾，濾液濃縮至100 mL。

2.4.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 本制劑是以原藥材飲片進(jìn)行投料煎煮的傳統(tǒng)劑型，方中含有較多根莖類(lèi)及種子類(lèi)堅(jiān)實(shí)藥材，水提過(guò)程中擴(kuò)散較慢，為利于成分充分浸出，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，并根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以溶媒用量、提取次數(shù)和提取時(shí)間為影響因素，確定優(yōu)化范圍，以5個(gè)指標(biāo)含量作為水提工藝的考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表3），按照實(shí)驗(yàn)安排表（見(jiàn)表4）平行稱(chēng)取17份藥材按照“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸含量，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)合歸一化法和權(quán)重系數(shù)計(jì)算總分，總分=（苦杏仁苷含量×0.193 7/最大苦杏仁苷含量+橙皮苷含量×0.449 8/最大橙皮苷含量+迷迭香酸含量×0.193 7/最大迷迭香酸含量+甘草酸含量×0.1050/最大甘草酸含量+總黃酮含量×0.057 7/最大總黃酮含量）×100，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 利用方差分析對(duì)各因素進(jìn)行多元二次回歸，得到的回歸方程Y=64.70+6.00A+13.99B+2.92C+4.42 AB+5.84A2+7.67B2，響應(yīng)面結(jié)果的方差分析見(jiàn)表5，結(jié)果顯示，水提工藝考察的3個(gè)因素中，溶媒用量（A）為顯著項(xiàng)，提取次數(shù)（B）為極顯著項(xiàng)，提取時(shí)間（C）為不顯著項(xiàng)；二次項(xiàng)中，B2為顯著項(xiàng)，表明考察因素與響應(yīng)面值之間并非簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。模型整體具有極顯著性（P=0.000 6），且失擬合程度不顯著（P=0.705 3），表明模型能較好地反映溶媒用量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）與評(píng)價(jià)指標(biāo)加權(quán)得分（Y）之間的變化關(guān)系，能夠預(yù)測(cè)和分析該水提工藝。按照所得模型繪制的溶媒用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間的交互作用對(duì)陳皮麻黃飲的水提工藝影響的3D響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖3，從圖3中可以看出，考察的3個(gè)對(duì)象3者交互作用不明顯。軟件Design Expert 12得出陳皮麻黃飲的水提工藝為溶媒用量12倍，提取次數(shù)3次，每次提取時(shí)間1 h。

圖3 溶媒用量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）交互作用的三維響應(yīng)面圖

表5 綜合得分回歸模型方差分析表

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)選工藝，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6，綜合評(píng)分說(shuō)明優(yōu)選的提取工藝合理可行。苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸、總黃酮平均含量分別為1.060 7、0.454 6、0.034 7、0.105 6、8.203 6 mg/mL，RSD分別為4.05%、4.70%、1.36%、2.65%、1.18%，預(yù)測(cè)綜合得分102.61，實(shí)際綜合得分（101.28±3.10），RSD為3.06%，與預(yù)測(cè)值差異較小，且在合理范圍內(nèi)，表明提取工藝結(jié)果穩(wěn)定，預(yù)測(cè)結(jié)果可信。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

陳皮麻黃飲的組方為9種常見(jiàn)的中藥，處方來(lái)源為二陳湯和三子養(yǎng)親湯加減化裁而成。本研究根據(jù)其組方配伍特點(diǎn)，選擇制劑中有效成分和組分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究。方中陳皮為君藥，研究表明橙皮苷為陳皮的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤、抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[10]；苦杏仁中的苦杏仁苷具有止咳、平喘、抗肺纖維化等藥理作用[11]；迷迭香酸為紫蘇子主要的酚酸類(lèi)活性成分[12]；甘草酸為甘草中主要活性成分之一[13-14]；黃酮類(lèi)化合物是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，在抗病毒、抗炎、降血脂、降血糖、抑菌和抗癌等方面發(fā)揮著重要的作用[15]。從有效成分充分提取的角度考慮，結(jié)合該方的君、臣、佐、使配伍關(guān)系，將橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸及總黃酮的含量作為考察指標(biāo)，采用AHP法對(duì)指標(biāo)賦權(quán)并結(jié)合歸一化法計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)總分，同時(shí)也兼顧處方的配伍特點(diǎn)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，既能有效保障提取的全面性，又符合中醫(yī)整體論治的指導(dǎo)原則[16]。

中藥復(fù)方提取液中黃酮類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)繁多，理化性質(zhì)也存在差異，而UV法的專(zhuān)一性較差，本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用直接UV法測(cè)定總黃酮含量，由于存在較強(qiáng)的背景吸收而導(dǎo)致測(cè)定值偏高。陳皮麻黃飲中以陳皮為君藥，其主要的有效成分為橙皮苷，屬于二氫黃酮類(lèi)化合物，在硝酸鋁顯色體系中不能產(chǎn)生特征吸收峰，因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用ZrOCl2比色法，利用水提液中的黃酮類(lèi)成分與ZrOCl2絡(luò)合反應(yīng)后，在313 nm波長(zhǎng)處吸光度值發(fā)生顯著變化，所測(cè)得的吸光度值與水提液中的黃酮類(lèi)組分在0.021 09～0.049 21 mg/mL范圍內(nèi)具良好線(xiàn)性關(guān)系，而水提液中的其他組分在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收，因此可較好避免背景吸收的干擾。

本實(shí)驗(yàn)采用的Box-Behnken是響應(yīng)面設(shè)計(jì)中常用方法，與正交法相比，響應(yīng)面法優(yōu)點(diǎn)在于精確度更高、模擬程度更好，更適合于多因素、多水平共同影響的實(shí)驗(yàn)，也兼顧了影響因素及各因素間的交互作用，通過(guò)二項(xiàng)式能更準(zhǔn)確地獲取與真實(shí)實(shí)驗(yàn)接近的最優(yōu)條件[17]。本次優(yōu)化的提取工藝簡(jiǎn)便易行，預(yù)測(cè)效果好，可以為進(jìn)一步的制劑研發(fā)提供理論依據(jù)。