基于自噬途徑探討黃芪甲苷抑制糖尿病腎病系膜細胞NLRP3炎癥小體活化通路及機制*

趙 靜，張麗英，康紅霞

（石家莊市第八醫院，河北 石家莊 050000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病中后期的嚴重并發癥，其致病機制較為復雜，氧化應激、炎癥反應等均參與了DN的不同病理過程并發揮重要作用[1-2]。當前研究表明，高糖狀態可引起氧化應激并激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體信號通路，促使IL-1β、IL-18等炎癥因子成熟與分泌，活性氧（reactive oxygen species，ROS）與炎癥因子等致病因子會增強機體的炎癥反應，加重機體的微炎癥狀態，并推動腎臟損傷纖維化的進展[3-4]。自噬是細胞清除受損物質，避免出現凋亡、壞死，維持自身穩態的自我保護機制。線粒體自噬可以有效清除受損線粒體減少ROS的產生，從而減輕機體的氧化應激狀態[5]。同時，自噬可以減輕機體過度免疫炎癥反應，可能對NLRP3炎癥小體信號通路起到一定的調節作用。當前，對于高糖條件下腎系膜細胞自噬及相關調節機制研究較少，臨床上也未出現能夠有效防治DN的特效藥物。但近些年的中醫學研究指出，DN病機在于機體陰陽失和，需治以補氣生血化瘀之法[6]。黃芪是臨床中常用的補中益氣類中藥，其可升陽舉陷、排毒消癰，常用于糖尿病、尿蛋白等病癥的治療。黃芪甲苷是黃芪的活性提取物，現代藥理研究表明，其具有較好的抗炎作用，可糾正細胞炎癥狀態，改善免疫功能紊亂[7]。有研究發現，黃芪甲苷可以減輕細胞氧化應激狀態，從而延緩DN病情進展[8]，我們猜想這與黃芪甲苷上調線粒體自噬水平，改善機體微炎癥狀態有關。本次研究基于自噬途徑探討了黃芪甲苷對高糖刺激的小鼠腎小球系膜細胞NLRP3炎癥小體活化通路的影響，旨在為DN的治療實驗依據。

1 材 料

1.1實驗細胞 小鼠腎小球系膜細胞株SV40 MES13購自American Type Culture Collection。

1.2 藥物與試劑黃芪甲苷（成都德恩特生物，批號：10083-24-6）；低糖DMEM培養基（美國Hyclone，批號：66754）；胎牛血清FBS（美國Gibco Life Technologies，批號：101917171027）；0.25%胰蛋白酶消化液（碧云天生物技術研究所，批號：P0013B）；ROS活性氧檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號：091217180110）；CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒（日本Dojindo，批號：BS3701）；Western blotting一抗稀釋液（碧云天生物技術研究所，批號：101617171102）。

1.3 主要儀器DYY-6C型凝膠電泳儀、Chem Doc XRS型凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad Laboratories）；Spectra Max 190型熒光酶標儀（美國BioTek Instruments）。

2 方 法

2.1 細胞培養將小鼠SV40細胞從液氮罐內取出并于37℃恒溫水浴箱中解凍，持續搖動冷凍管確保細胞在2 min內完全融化。采用醫用酒精對冷凍管表面消毒，在超凈工作臺內將細胞懸浮液轉移至離心管，700 r/min離心5 min。棄上清加入5 mL培養基，使用移液槍充分吹打后轉移至培養瓶，放入37℃5%CO2恒溫培養箱中培養。

2.2 小鼠SV40細胞分組將小鼠SV40細胞分為5組，分別在含有0、10、20、40、80 μmol/L黃芪甲苷的DMEM培養基中體外培養48 h，采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞活力，篩選出適宜的黃芪甲苷濃度進行后續實驗。根據CCK-8檢測結果，本實驗選取10、20、40 μmol/L黃芪甲苷作為低、中、高劑量。

2.3 高糖刺激小鼠SV40細胞復蘇后制備成細胞懸液接種于35 mm2培養基，放入37℃5%CO2恒溫培養箱中培養。細胞長至70%～80%匯合時換不含胎牛血清的DMEM培養基繼續培養24 h至90%匯合。將細胞在含胎牛血清的DMEM培養基內培養并分為5組，即正常對照組（葡萄糖5.6 mmol/L）、高糖組（葡萄糖30 mmol/L）、黃芪甲苷低劑量組（葡萄糖30 mmol/L+黃芪甲苷10 μmol/L）、黃芪甲苷中劑量組（葡萄糖30 mmol/L+黃芪甲苷20 μmol/L）、黃芪甲苷高劑量組（葡萄糖30 mmol/L+黃芪甲苷40 μmol/L），以上各組均培養24 h。

2.4 細胞增殖毒性檢測采用移液槍取100 μL細胞懸液加入96孔板中，37℃5%CO2恒溫培養箱預培養24 h。培養皿內加入不同濃度黃芪甲苷，37℃5%CO2恒溫培養箱培養48 h。更換培養基，孔內加入10 μL CCK-8溶液37℃5%CO2恒溫培養箱繼續培養2 h，酶標儀檢測450 nm處樣品OD值。Ap：含細胞培養基+CCK-8溶液+黃芪甲苷；Ac：含細胞培養基+CCK-8溶液；A0：空白孔。細胞活力（%）=[（Ap-A0）/（Ac-A0）]×100%。

2.5 TUNEL細胞凋亡檢測收集小鼠SV40細胞并用PBS溶液漂洗1次，室溫條件下4%多聚甲醛浸泡30 min后，用PBS溶液漂洗2次。室溫條件下在含0.1%Triton X-100的PBS溶液中孵育5 min后，漂洗3次，加入50 μL TUNEL混合溶液，37℃避光孵育1 h。PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下鏡檢。

2.6 炎癥因子水平檢測收集小鼠SV40細胞離心取上清液，按比例稀釋樣品之后加入相應孔內，蓋上封口膜室溫孵育2 h。板洗凈5次，用吸水紙干燥。孔內加入100 μL辣根過氧化物標記鏈霉親和素，封閉后室溫避光孵育20 min。板洗凈5次，用吸水紙干燥。孔內加入100 μL TMB顯色溶液，封閉后室溫避光孵育20 min。孔內加入50 μL終止液，酶標儀檢測450 nm處樣品OD值，計算IL-1β、IL-18、TNF-α、TNF-β1水平。

2.7 ROS水平檢測按照1:1 000比例采用無血清培養基稀釋DCFH-DA，配制10 μmol/L DCFH-DA。收集小鼠SV40細胞，離心棄上清，加入配制好的DCFH-DA，采用移液槍反復吹打確保細胞懸浮。細胞培養箱內37℃條件下孵育20 min，每3 min混勻一次，確保細胞與DCFH-DA完全接觸。細胞采用無血清培養基漂洗3次，采用PBS溶液制備細胞懸浮液，使用流式細胞儀檢測樣品525 nm波長熒光強度。

2.8 細胞自噬形態觀察透射電鏡下觀察小鼠SV40細胞自噬形態，并計算同等放大倍數下各組細胞自噬體數量。

2.9 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測LC3、Beclin-1、NLRP3、Caspase-1蛋白表達量收集小鼠SV40細胞，采用預冷PBS溶液漂洗3次后棄廢液，加入適量RIPA裂解液充分研磨后轉入EP管內冰上靜置5 min。超聲破碎儀破碎后離心，移液槍回收上清液。樣本液中加入上樣緩沖液，采用高速震蕩器混勻，之后100℃水浴變性10 min，標記好保存于-20℃冰箱內備用。之后經SDS-PAGE電泳與濕轉法轉膜，封閉后經一抗、二抗孵育，化學發光顯影后采用圖像處理軟件進行分析。

2.10 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，數據進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 不同濃度黃芪甲苷培養小鼠SV40細胞活力檢測CCK-8檢測結果表明，10～40 μmol/L黃芪甲苷培養小鼠SV40細胞未表現出明顯細胞毒性，對小鼠SV40細胞活力無明顯影響。采用80 μmol/L黃芪甲苷培養小鼠SV40細胞其細胞活力較0 μmol/L黃芪甲苷培養時明顯下降（P＜0.05），提示80 μmol/L黃芪甲苷培養對小鼠SV40細胞具有明顯的毒性作用。故本次研究選取10、20、40 μmol/L分別作為黃芪甲苷低、中、高劑量。（見圖1）

圖1 各組小鼠SV40細胞活力比較（±s，n=6）

3.2 各組小鼠SV40細胞凋亡及細胞活力比較與正常對照組比較，高糖刺激下小鼠SV40細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），細胞活力明顯下降（P＜0.01），提示高糖刺激可抑制細胞活力并誘導細胞凋亡。與高糖組比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組小鼠SV40細胞凋亡率均下降，細胞活力均提升，且黃芪甲苷中、高劑量組小鼠SV40細胞凋亡率和細胞活力與高糖組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖2～4）

圖2 各組小鼠SV40細胞凋亡情況（TUNEL法，×200）

圖3 各組小鼠SV40細胞凋亡率比較（±s，n=6）

圖4 各組小鼠SV40細胞活力比較（±s，n=6）

3.3 各組小鼠SV40細胞炎癥因子水平比較與正常對照組比較，高糖組小鼠SV40細胞IL-1β、IL-18、TNF-α、TGF-β1水平均明顯升高（P＜0.01），提示高糖刺激下可誘導多種炎癥因子成熟、分泌，加重細胞的微炎癥狀態。與高糖組比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組小鼠SV40細胞炎癥因子水平均降低，且黃芪甲苷中、高劑量組小鼠SV40細胞IL-1β、IL-18、TNF-α、TGF-β1水平均低于高糖組（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖5）

圖5 各組小鼠SV40細胞炎癥因子水平比較（±s，n=6）

3.4 各組小鼠SV40細胞ROS水平比較與正常對照組比較，高糖組小鼠SV40細胞ROS水平明顯升高（P＜0.05），提示高糖刺激可誘導細胞產生ROS。與高糖組比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組小鼠SV40細胞ROS水平均降低，且黃芪甲苷中、高劑量組小鼠SV40細胞ROS水平均低于高糖組（P＜0.05）。（見圖6）

圖6 各組小鼠SV40細胞ROS水平比較（±s，n=6）

3.5 系膜細胞自噬形態與正常對照組比較，高糖組系膜細胞自噬體明顯減少，腎間質出現纖維化。與高糖組比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組系膜細胞自噬體均增多，說明黃芪甲苷上調了線粒體自噬，對小鼠SV40細胞起到保護作用，隨著黃芪甲苷劑量的增加，自噬體的數目隨之增多。（見圖7）

圖7 透射電鏡觀察系膜細胞自噬形態

3.6 各組小鼠SV40細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin1水平比較與正常對照組比較，高糖組小鼠SV40細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達水平均明顯下調（P＜0.01），提示高糖刺激下細胞自噬受到明顯抑制。與高糖組比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組小鼠SV40細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1表達水平均上調，且黃芪甲苷中、高劑量組小鼠SV40細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin1表達水平高于高糖組（P＜0.05或P＜0.01），提示黃芪甲苷可在一定程度上提升線粒體自噬水平。（見圖8）

圖8 各組小鼠SV40細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin-1水平比較（±s，n=6）

3.7 各組小鼠SV40細胞NLRP3、Caspase-1水平比較與正常對照組比較，高糖組小鼠SV40細胞NLRP3、Caspase-1水平明顯上調（P＜0.01），提示高糖可激活NLRP3炎癥小體信號通路，加重炎癥反應。與高糖組比較，黃芪甲苷低、中、高劑量組小鼠SV40細胞NLRP3、Caspase-1水平均下調，且黃芪甲苷中、高劑量組小鼠SV40細胞NLRP3、Caspase-1水平均低于高糖組（P＜0.05或P＜0.01），提示黃芪甲苷可抑制NLRP3炎癥小體信號通路活化，減輕細胞微炎癥。（見圖9）結合細胞LC3、Beclin-1表達水平變化，我們猜測黃芪甲苷可以通過上調線粒體自噬水平抑制NLRP3炎癥小體信號通路活化。

圖9 各組小鼠SV40細胞NLRP3、Caspase-1水平比較（±s，n=6）

4 討 論

中醫學中并無DN病名，但其特征與“關格”“水腫”“尿濁”“消癉”記載相似[9]。血流阻滯，氣機不暢，痰濕無法外排導致陰氣瘀積，絡息成積最終會引起脈絡病變，并推動DN進展。現代醫學研究表明，DN的發生與進展與血流動力學變化、糖基化終末產物積累、蛋白酶激活等多種途徑相關，但以上途徑都與炎癥有密切關聯[10]。近年來的研究則指出炎性小體在DN中具有重要作用。MARTINON F等[11]指出NLRP3炎癥小體聯通下游信號級聯IL-1β、IL-18等致炎因子可誘發多種炎癥疾病。炎癥小體是固有免疫的受體及傳感器，可以活化Caspase-1并誘導炎癥反應，其具體過程為炎癥小體募集并激活Caspase-1，活化的Caspase-1切割前體pro-IL-1β與pro-IL-18，促使其形成成熟的IL-1β、IL-18[12]。當前研究指出，NLRP3可被多種病原體激活，其驅動模式之一為高糖、ATP等物質刺激，包括線粒體產生的ROS、K+內流，以及線粒體轉位等[13]。以上因素可以促進NLRP3形成多聚體復合物并誘導下游炎癥通路活化。研究發現NLRP3炎癥小體在DN大鼠腎臟中表達增強，炎癥因子IL-1β、IL-18表達水平明顯上調。DN疾病初期腎小球內NLRP3活化，通過抑制Caspase-1與ASC分泌能夠有效改善腎小球硬化進程，延緩DN疾病進展[14]，可見NLRP3炎癥小體活化與DN有密切關聯。

ROS作為炎癥介質可以通過高糖刺激誘導NLRP3炎癥小體活化，TSCHOPP J等[15]發現MitoTempo干預可下調NLRP3炎癥小體表達水平，MitoTempo是擬過氧化物歧化酶，可以降低ROS含量。該研究證實了DN中NLRP3炎癥小體激活與ROS密切相關。TAGAWA A等[16]發現DN的發生與進展和自噬抑制有密切關聯。自噬可以及時清除腎臟內的代謝廢物、受損及衰老細胞，一旦自噬受到抑制，以上物質便會在細胞外基質不斷堆積，繼而誘發腎小球病變。LC3、Beclin-1均為自噬調節因子，前者可以調節Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶活性，促進自噬體膜形成，后者可由LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ蛋白構成，LC3-Ⅰ在自噬體成熟過程中起到關鍵作用，且其表達水平亦會對LC3-Ⅱ表達水平產生影響。KITADA M等[17]研究指出，DN患者病情與細胞自噬水平相關，自噬水平受到抑制則疾病進展，反之自噬水平上調可以緩解DN病情，降低微量尿蛋白水平。

近年來，許多學者著手中醫藥治療DN的研究并取得了一定成效。葉太生等[18]采用當歸補血湯對DN大鼠進行灌胃，結果表明DN大鼠的腎功能得到有效改善，認為當歸補血湯中的君藥黃芪的主要有效成分黃芪甲苷可以抗炎降壓，在治療腎損害中發揮了重要作用。張筠等[19]研究了雷公藤多苷對DN大鼠腎細胞自噬的影響，發現雷公藤多苷可以抑制核因子-κB活化，從而有效抑制IL-6、IL-8等細胞因子活化，并抑制免疫細胞趨化、浸潤，推斷雷公藤多苷對大鼠腎功能的保護作用可能與抑制細胞氧化應激反應、激活自噬功能有關。李瑞杰等[20]觀察了銀杏葉提取物對早期DN大鼠炎癥反應的影響，發現銀杏葉提取物可以抑制NLRP3炎癥小體激活發揮腎臟保護作用。以上中藥或中藥有效成分均從抑制炎癥反應出發，通過調節氧化應激反應，抑制NLRP3炎癥小體激活等方面起到治療DN的效果。

本研究表明，高糖刺激會誘導小鼠SV40細胞發生一系列病理變化，包括自噬體減少、腎間質纖維化等，同時NLRP3炎癥小體通路激活，導致ROS、炎癥因子水平升高，并誘導細胞發生凋亡，降低細胞活力。高糖誘導的細胞加入黃芪甲苷干預后可見細胞內自噬體增多，黃芪甲苷干預后LC3、Beclin-1表達水平均上調。結果提示自噬抑制現象有效緩解。黃芪甲苷低、中、高劑量組小鼠SV40細胞NLRP3、Caspase-1水平均下調，提示黃芪甲苷干預可以抑制NLRP3炎癥小體通路活性，并降低凋亡相關蛋白Caspase-1表達水平，從而抑制細胞凋亡，提高細胞活力。黃芪甲苷干預后各組小鼠SV40細胞ROS、炎癥因子表達水平均顯著下降。結合研究結果，我們推測細胞自噬水平上調清除了堆積的有害物質，減少了ROS產生，NLRP3炎癥小體通路刺激物ROS減少，其激活途徑受到抑制，降低了IL-1β、IL-18等炎癥因子的表達水平，從而起到改善DN病情進展，保護SV40細胞的效果。

綜上所述，高糖可誘導NLRP3炎癥小體通路激活，并促使多種炎癥因子分泌加重DN病情。黃芪甲苷可以有效降低細胞炎癥因子水平，保護細胞功能，其機制可能在于上調細胞自噬水平并抑制NLRP3炎癥小體通路激活，從而改善機體氧化應激與過度炎癥反應。