重樓皂苷Ⅰ對胃癌SGC-7901細胞線粒體自噬的作用及對LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Caspase-3表達的影響

張秉麗，霍成英，李有連

（青海仁濟醫院，青海 西寧 810000）

胃癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，在我國的發病率與病死率僅次于肺癌與肝癌，居第3位，其發病率和病死率仍在逐年上升[1]。而且，胃癌早期臨床癥狀不明顯，確診時多為胃癌中晚期，化療、放療及手術治療療效不明顯，嚴重威脅人類生命健康[2]。胃癌患者臨床治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤侵襲轉移和復發。自噬是存在于真核細胞內利用溶酶體降解自身受損細胞器和大分子物質的過程，是細胞應對惡劣環境的生存機制，與腫瘤的發生、增殖、侵襲轉移等密切相關。重樓皂苷Ⅰ是從中藥重樓中提取的一種小分子單體，屬于甾體皂苷，毒副作用小、抗腫瘤效應強，能影響多種腫瘤細胞和移植瘤的生長[3-4]。研究表明，重樓皂苷Ⅰ通過調節細胞自噬能夠抑制胃癌細胞侵襲能力[5]。微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是線粒體自噬標記蛋白，參與自噬膜的形成，是自噬形成的標志性因子，研究發現，LC3與腫瘤的發生發展密切相關[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartatespecific proteinases 3，Caspases-3）是細胞凋亡效應因子，高表達可誘導細胞凋亡[6]。重樓皂苷Ⅰ抑制腫瘤的作用早有報道，但其發揮作用的機制尚不清楚，是否通過調控自噬與凋亡發揮作用有待證實。本研究主要探討重樓皂苷Ⅰ對胃癌SGC-7901細胞線粒體自噬的作用及對線粒體自噬標記蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和凋亡蛋白Caspase-3表達的影響。

1 材 料

1.1 細胞系人胃癌SGC-7901細胞，購買于美國ATCC公司。

1.2 試劑重樓皂苷Ⅰ（成都普瑞法科技開發有限公司，純度：95%～99%，規格：100 mg，批號：180223）；胎牛血清（批號：150712）、1640-RPMI培養基（批號：161124）、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（批號：180414）均購自美國Gibco公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：170927）；二甲基亞砜（美國Sigma公司，批號：161117）；兔抗人Beclin-1單克隆抗體（批號：081105）、兔抗人LC3-Ⅰ單克隆抗體（批號：201412）、兔抗人LC3-Ⅱ單克隆抗體（批號：150413）、兔抗人Bcl-2單克隆抗體（批號：101019）、兔抗人Bax單克隆抗體（批號：180522）、兔抗人Caspase-3單克隆抗體（批號：170915）、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔多抗（批號：190308）均購自英國abcam公司。

1.3 主要儀器TE2000-U型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司）；FACSCalibu型流式細胞儀系統（美國BD公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養將SGC-7901胃癌細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640-RPMI培養基中，置于含5%CO2恒溫37℃的細胞培養箱中培養。2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2 分組及藥物處理用含10%胎牛血清的1640-RPMI液體培養基溶解重樓皂苷Ⅰ，分成重樓皂苷Ⅰ低劑量組、重樓皂苷Ⅰ中劑量組、重樓皂苷Ⅰ高劑量組，分別以質量濃度為1.5、3.0、6.0 mg/mL重樓皂苷Ⅰ培養胃癌細胞。對照組用含10%胎牛血清的1640-RPMI培養基培養胃癌細胞。

2.3 細胞增殖抑制率檢測取對數生長期SGC-7901細胞，PBS沖洗，胰酶消化5 min，細胞密度1×105個/mL，接種于96孔板。細胞貼壁后，對照組、重樓皂苷Ⅰ低劑量組、重樓皂苷Ⅰ中劑量組、重樓皂苷Ⅰ高劑量組更換為對應的培養基，200μL/孔，分別培養24、48、72h。在各時間段結束前4 h每孔加20μL 5mg/mL的MTT溶液，孵育4 h，每孔加150 μL DMSO，充分震蕩10 min，用全自動酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度（A）值，每組每個時間點均設置5個復孔，計算增殖抑制率。增殖抑制率=（對照孔A值-藥物孔A值）/對照孔A值×100%。

2.4 透射電鏡觀察SGC-7901細胞超微結構的改變取各組培養72 h的SGC-7901胃癌細胞加入體積分數2.5%戊二醛和1%鋨酸固定細胞，丙酮脫水，制片，鉛、鈾各復染10 min，透射電子顯微鏡下對細胞自噬小體進行觀察，拍照。

2.5 Lyso-Tracker Red染色觀察SGC-7901細胞自噬情況取各組培養72 h的SGC-7901胃癌細胞，PBS清洗后，暗室中加入50 nmol/L的Lyso-Tracker Red染液，孵育30 min，清洗。加入Hoechst 33342染液再次孵育20 min，清洗后制片，6 h內置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，鏡下紅色熒光小體為溶酶體。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取各組培養72 h的SGC-7901胃癌細胞，胰酶消化，收集細胞，室溫2 000 r/min離心5 min，離心半徑8 cm，棄上清，用提前預冷的PBS漂洗后，加入195 μL Binding buffer重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC，4℃避光孵育15 min，加入10 μL PI染色5 min，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。每組均設5個復孔。

2.7 Western blotting法檢測胃癌細胞Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量取各組培養72 h的SGC-7901胃癌細胞，收集細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔加入蛋白樣品40 μL，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，5%脫脂奶粉孵育1 h，加1∶1 000稀釋的Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入1∶4 000相應的辣根過氧化物酶標記的二抗，搖床室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加ECL超敏發光液，凝膠成像系統顯影，以目的蛋白和β-actin蛋白條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

2.8 統計學方法采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 重樓皂苷Ⅰ對細胞增殖的影響24、48、72 h細胞增殖抑制率各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組24、48、72 h細胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ中、高劑量組24、48、72 h細胞增殖抑制率均升高（P＜0.05），且重樓皂苷Ⅰ高劑量組各時間細胞增殖抑制率高于重樓皂苷Ⅰ中劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組細胞增殖抑制率均隨時間延長而增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 重樓皂苷Ⅰ對細胞增殖的影響（±s，n=5）

3.2 透射電鏡觀察SGC-7901細胞超微結構的改變對照組SGC-7901細胞結構完整，線粒體形態、核仁等正常，僅可見少量自噬小體形成；重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組SGC-7901胃癌細胞橢圓形的雙層膜包繞囊泡狀結構增多，內含有各種蛋白及線粒體，自噬小體數量逐漸增多。（見圖2）

圖2 各組SGC-7901細胞超微結構比較

3.3 Lyso-Tracker Red染色觀察SGC-7901細胞自噬情況Lyso-Tracker Red染色結果顯示，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組SGC-7901胃癌細胞溶酶體紅色熒光小體增加，出現酸性自噬溶酶體囊泡過度累積的現象。（見圖3）

圖3 各組SGC-7901細胞自噬情況比較

3.4 細胞凋亡率比較細胞凋亡率組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ中、高劑量組細胞凋亡率升高（P＜0.05），且重樓皂苷Ⅰ高劑量組細胞凋亡率高于重樓皂苷Ⅰ中劑量組（P＜0.05）。（見表1、圖4）

圖4 各組胃癌SGC-7901細胞凋亡情況

表1 各組細胞凋亡率比較（±s，n=5）

表1 各組細胞凋亡率比較（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，bP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ中劑量組比較，cP＜0.05

組別 凋亡率對照組 2.21±1.32重樓皂苷Ⅰ低劑量組 12.72±1.39a重樓皂苷Ⅰ中劑量組 26.25±2.73a b重樓皂苷Ⅰ高劑量組 38.87±3.22a b c F 36.772 P 0.000

3.5 各組胃癌細胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比較Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）。與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ中、高劑量組Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅰ中劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ高劑量組Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）。（見表2、圖5）

表2 各組胃癌細胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比較（±s，n=5）

表2 各組胃癌細胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比較（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，bP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ中劑量組比較，cP＜0.05

組別 Beclin-1 Caspase-3 LC3-Ⅰ/LC3-ⅡBcl-2/Bax對照組 0.39±0.06 0.41±0.05 1.13±0.12 1.27±0.13重樓皂苷Ⅰ低劑量組0.52±0.07a 0.65±0.07a 0.83±0.09a 0.96±0.10a重樓皂苷Ⅰ中劑量組0.88±0.09ab 0.91±0.10ab 0.63±0.07ab 0.82±0.09ab重樓皂苷Ⅰ高劑量組1.14±0.11abc 1.16±0.13abc 0.38±0.04abc 0.53±0.06abc F 36.773 42.383 28.427 39.036 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組胃癌細胞Beclin-1、Caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax蛋白表達Western blotting圖

4 討 論

胃癌是源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，由多種因素引起，慢性胃炎等胃部疾病，或幽門螺桿菌感染，以及不良飲食習慣、環境和遺傳等多種因素的共同作用，導致胃癌的發生[7]。近年研究發現，多種中藥活性成分具有抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡的作用，臨床上使用中藥治療惡性腫瘤療效顯著，可改善化療后毒性反應，使用安全且不良反應較小，具有廣闊的應用前景[8]。臨床研究證實，重樓皂苷Ⅰ可誘導肝癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及子宮癌等多種惡性腫瘤細胞凋亡，具有顯著的抗癌作用，探討重樓皂苷Ⅰ抗癌機制，對于提高腫瘤患者生存率意義重大[9-10]。

重樓皂苷Ⅰ主要提取自百合科植物云南重樓或七葉一枝花干燥根莖，藥理學活性較廣泛，包括抗腫瘤、免疫調節、保護心血管等，且能抑制腫瘤細胞增殖。線粒體自噬是細胞清除體內損傷線粒體及維持自身穩態的一種重要調節機制，為細胞應對惡劣環境的生存機制，在腫瘤發生、增殖、侵襲、轉移等過程中發揮重要作用，且受多種調控因子影響[5]。近年來，重樓皂苷Ⅰ的臨床研究不斷深入，發現重樓皂苷Ⅰ可誘導多種腫瘤細胞自噬，以發揮抗腫瘤作用。WANG W P等[11]研究表明重樓皂苷Ⅰ不僅能誘導人肝癌細胞出現Caspase依賴的線粒體途徑凋亡，還能誘導腫瘤細胞線粒體自噬，影響細胞內自噬標志蛋白表達水平。陳舒怡等[12]發現重樓皂苷Ⅰ可通過線粒體碎裂，誘導人肺癌NCI-H661細胞凋亡。這些研究均提示重樓皂苷Ⅰ可能在腫瘤細胞線粒體自噬中發揮重要作用，但目前臨床就重樓皂苷Ⅰ對胃癌SGC-7901細胞線粒體自噬作用仍無明確定論。本研究結果顯示，重樓皂苷Ⅰ各劑量組給藥后細胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高，自噬小體及自噬溶酶體數量增多，這提示重樓皂苷Ⅰ可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，促進線粒體自噬，進而促進細胞凋亡。

LC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，包括Ⅰ型與Ⅱ型。發生自噬時，LC3-I脂質化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結合并定位在胞內自噬體膜上。LC3-Ⅱ含量與自噬體數量呈正比，是自噬起始階段的分子標記物。研究發現類風濕關節炎患者機體處于氧化應激狀態，低濃度H2O2能促進類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖，白藜蘆醇可抑制類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖和促進凋亡，其機制可能與降低自噬蛋白LC3-I/II、Beclin-1表達有關[13]。Caspases家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件，其激活與過表達會引起細胞凋亡，并通過與眾多蛋白因子相互作用調控細胞凋亡[14]。Caspase-3處于凋亡有序級聯反應的下游，是細胞凋亡的關鍵執行者與主要效應因子，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是凋亡進入不可逆階段標志[15]。劉文粵等[16]發現藤黃酸能夠誘導Caspase-3活性促進食管鱗狀細胞癌TE-1細胞凋亡。研究發現胞漿轉導肽介導抑癌基因導入腎癌786-O細胞中，并對腎癌786-O細胞有明顯的抑制作用，可能是通過影響Bax-Caspase-3凋亡通路的活性，抑制786-O細胞的增殖，誘導凋亡發揮抑癌作用[17]。本研究中重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組與對照組比較，Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，且效果呈劑量依賴性，提示重樓皂苷-Ⅰ能促進人胃癌SGC-7901細胞線粒體自噬，可通過上調Beclin-1、Caspase-3的表達，降低Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值，誘導自噬，促進凋亡，發揮抗癌作用。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ促進胃癌SGC-7901細胞線粒體自噬，可能是通過調控凋亡及自噬相關基因，上調Caspase-3，降低LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ發揮作用。