EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達與腎透明細胞癌臨床特征的相關性

陳海濱，趙建軍，程小龍，譚超

腎癌又稱腎細胞癌，約占每年新發成人惡性腫瘤的3%，是最常見的惡性腫瘤之一，且其發病率在過去的幾十年一直呈現不斷上升的趨勢[1-2]。腎細胞癌最常見的組織類型為腎透明細胞癌，約占腎細胞癌的85%[3]。腎透明細胞癌的發病機制目前尚不明確，但研究表明，基因甲基化可能與其發生、發展有一定聯系[4]。內皮PAS區域蛋白1(endothelial PAS domain protein 1，EPAS-1)又稱缺氧誘導因子2，與腫瘤血管生成及預后具有密切聯系，是惡性腫瘤的獨立預后因素[5]。雖然缺氧誘導因子在腎細胞癌中的研究較多[6-7]，但關于EPAS-1基因甲基化及蛋白表達水平與腎透明細胞癌的關系研究仍較少。因此，現分析EPAS-1基因甲基化及蛋白表達水平與腎透明細胞癌臨床特征及預后的關系，以期為腎透明細胞癌基因治療提供新的靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月—2015年8月于河北工程大學附屬醫院泌尿外二科診治腎透明細胞癌患者86例的癌組織為研究對象(腎透明細胞癌組)，男52例，女34例，年齡46～76(59.92±11.49)歲。選取其癌旁正常組織作為癌旁對照組。(1)納入標準：①經影像學檢查、臨床特征及病理證實確診為腎透明細胞癌患者，符合腎透明細胞癌診療指南[8]；②病歷資料齊全者；③術前未接受過放療、化療等輔助治療。(2)排除標準：①有嚴重精神障礙者；②合并其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者；③合并其他感染性疾病及嚴重肝、腎功能異常者；④已參與其他臨床試驗或因其他原因不能參與本試驗者。本研究經醫院倫理委員會批準[審批號：2014(K)020]，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑與材料 (1)試藥試劑：DNA抽提試劑盒(德國QIAGEN公司)，CpGenome DNA Modification Kit(德國Merck Millipore公司)，DAB顯色試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)，EPAS-1抗體(武漢益普生物科技有限公司)，PTG19-T載體(上海信帆生物科技有限公司)，XL-10 Gold感受態細胞(上海烜雅生物科技有限公司)；(2)儀器設備：PCR儀(美國Bio-Rad公司)，紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 樣品采集及保存：術中采集患者腎透明細胞癌組織及其癌旁正常組織，一部分置于-80℃保存用于提取DNA；一部分10%甲醛固定標本后，進行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。

1.3.2 EPAS-1基因甲基化測定：DNA抽提試劑盒提取腎透明細胞癌組織及其癌旁正常組織基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA純度。DNA純度檢測后進行PCR反應，PCR反應體系共50 μl：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，2×PCR Mix 25 μl，雙蒸水(ddH2O) 21 μl。PCR擴增條件：95℃預變性6 min,94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，75 ℃ 40 s，40個循環。由上海生工生物工程股份有限公司合成引物及測序，甲基化數據用BIQ Analyzer軟件分析和整理。EPAS-1甲基化引物序列上游：5＇-GAGTAGGAAGGGTATAAGG-3＇，下游：5＇-TCCCGAAGTTAGAGGGACCA-3＇；非甲基化引物序列上游：5＇-GGTTGTCGTATACCTGGACT-3＇，下游：5＇-GTTGTCCGCCTACCTTCTGAAG-3＇。以2-△△CT法計算EPAS-1基因甲基化水平。

1.3.3 EPAS-1蛋白水平檢測：采用免疫組織化學法檢測組織EPAS-1蛋白表達水平。將切片脫蠟、水化及抗原熱修復(乙二胺四乙酸二鈉緩沖液100℃)；滴加過氧化物酶阻斷溶液，并采用動物非免疫血清室溫封閉；滴加一抗EPAS-1(1∶50稀釋)，陰性對照為聚丁二酸丁二醇酯(PBS)緩沖液；生物素標記的二抗進行室溫孵育后滴加鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶溶液；PBS緩沖液沖洗后，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢，之后采取半定量法進行評分。雙盲進行結果判定，每張切片分別由2名病理科醫師判讀，每個標本取2次觀察評分的平均值。按染色強度計分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分；按照陽性細胞率計分，陽性細胞百分數≥76%，51%～75%，26%～50%，6%～25%，≤5%分別判定為4、3、2、1、0分。將上述2項得分相乘，總分<5分為陰性(-)，≥5分為陽性(+)。

1.3.4 隨訪情況：手術后5年內采用電話、入戶和患者入院復查等方式進行隨訪，術后第1～3年每3～6個月隨訪1次，4～5年每6個月隨訪1次。其生存期從手術之日起計算，隨訪截至2020年8月31日。

1.4 統計學方法 利用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。計數資料以頻數或率(%)表示，組間比較行χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法分析腎透明細胞癌患者EPAS-1甲基化水平及蛋白表達與預后的關系，用Log-rank進行生存曲線顯著性檢驗，采用多因素Cox回歸分析影響腎透明細胞癌預后的因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組EPAS-1基因甲基化狀態及蛋白表達比較 腎透明細胞癌組EPAS-1基因甲基化率為62.79%(54/86)，顯著高于癌旁對照組的16.28%(14/86)，差異有統計學意義(χ2/P=38.914/0.000)。腎透明細胞癌組EPAS-1蛋白表達陽性率為23.26%(20/86)，顯著低于癌旁對照組的65.12%(56/86)，差異有統計學意義(χ2/P=30.553/0.000)，見圖1。

癌旁正常組織 腎透明細胞癌組織

2.2 癌組織EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達在不同臨床/病理特征中比較 不同性別、年齡、WHO/ISUP分級患者中癌組織EPAS-1基因甲基化率及蛋白表達陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑≥4.0 cm、Fuhrman分級高級別癌組織EPAS-1甲基化率高于腫瘤<4.0 cm、Fuhrman分級低級別患者(P<0.01)，蛋白表達陽性率低于腫瘤<4.0 cm、Fuhrman分級低級別患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 腎透明細胞癌患者癌組織EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達在不同臨床/病理特征中比較 [例(%)]

2.3 癌組織EPAS-1基因甲基化水平及蛋白表達與腎透明細胞癌患者預后的關系 Kaplan-Meier法結果顯示，EPAS-1基因甲基化腎透明細胞癌患者5年生存率51.85%(28/54)，低于EPAS-1基因非甲基化患者的78.13%(25/32)，差異有統計學意義(χ2=5.865，P=0.015)；EPAS-1蛋白陽性表達腎透明細胞癌患者5年生存率85.00%(17/20)，高于EPAS-1蛋白陰性表達患者的54.55%(36/66)，差異有統計學意義(χ2=6.020，P=0.014)。

2.4 影響腎透明細胞癌患者預后的多因素Cox回歸分析 EPAS-1基因甲基化是影響腎透明細胞癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.01)，EPAS-1蛋白陽性表達是影響腎透明細胞癌患者死亡的保護因素(P<0.01)，見表2。

表2 影響腎透明細胞癌患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

腎細胞癌早期臨床表現不典型，通過影像學及病理檢查等確診時，多已屬于晚期，預后較差[9-10]。對于晚期的腎細胞癌患者，疾病無法根治，且存在耐藥問題[11-13]。目前關于腎透明細胞癌的生物標志物研究較少，因此，尋找切實有效的腎透明細胞癌腫瘤標志物顯得尤為重要。

表觀遺傳學改變是多種腫瘤的特征，而DNA甲基化驅動轉錄調控是表觀遺傳的重要組成，也是腫瘤細胞中一些功能基因沉默或失活的常見機制[14-15]。已有研究表明，DNA甲基化在腎透明細胞癌中發揮重要作用[16]。EPAS-1是細胞和組織缺氧的主要轉錄因子，在低氧引起的酶或因子變化中起到重要作用[17]。EPAS-1主要在低氧區域誘導表達，同時調節腫瘤為適應低氧狀態所必需的基因表達，進而在血管生長、能量代謝、腫瘤發生發展中起重要作用[18]。目前關于EPAS-1與腎透明細胞癌病理學參數、預后的關系及其在腎透明細胞癌中的差異表達均尚不清楚。本研究結果顯示，與癌旁對照組相比，腎透明細胞癌組EPAS-1基因甲基化率顯著升高，EPAS-1蛋白表達陽性率顯著降低，與成永忠等[19]研究結果中EPAS-1的作用相似。提示EPAS-1基因啟動子高甲基化及蛋白低表達可能與腎透明細胞癌的發生、發展有關。此外，本研究中癌組織EPAS-1基因甲基化、蛋白表達與腫瘤直徑及Fuhrman分級有關，提示EPAS-1基因甲基化可能參與腎透明細胞癌的侵襲和轉移等過程，且基因甲基化可能多發生于腫瘤≥4.0 cm、Fuhrman分級高級別的腎透明細胞癌患者。Xu等[20]研究顯示，EPAS-1啟動子甲基化可降低EPAS-1 mRNA在非小細胞肺癌中的表達水平。本研究5年生存分析及影響因素結果提示，EPAS-1基因發生甲基化及蛋白低表達可能不利于患者預后。結合既往研究，推測可能機制為：缺氧時穩定的EPAS-1反式激活，進一步促進EPAS-1啟動子的特異性甲基化，其甲基化可能導致EPAS-1基因在腎透明細胞癌中的表達失活，進而使得EPAS-1蛋白無法參與細胞周期的調控，導致腫瘤細胞迅速生長，腎透明細胞癌患者病情加重，死亡幾率增加。

綜上所述，EPAS-1基因甲基化及蛋白表達水平與腎透明細胞癌的臨床病理特征及預后密切相關，對EPAS-1基因甲基化的研究可能為今后尋找更多的腎透明細胞癌腫瘤分子生物學標志物起到積極的推動作用。然而本研究檢測甲基化過程中有可能會出現非特異性擴增，進而可能會造成研究結果存在一定的偏倚，有待今后采用更先進的檢測技術、納入更多樣本進一步深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

陳海濱：提出研究方向、研究思路，研究選題，設計論文框架，撰寫論文；趙建軍：設計研究方案、研究流程，論文撰寫；程小龍：實施研究過程，數據收集，分析整理試驗數據，進行統計學分析；譚超：進行文獻調研與整理，論文修改