整體柱固相萃取結合GC-MS鑒定中藥蒼術水煎液化學成分

張帆，程佳喆，焦盼，唐鋮

（天津醫科大學藥學院天然藥物學系，天津300070）

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea或北蒼術Atractylodes chinensis的干燥根莖[1]，具有燥濕健胃、祛風濕、明目、抗炎等功效，能治濕困脾胃、倦怠嗜臥、食欲不振、肢節酸痛、夜盲等癥[2-4]。該藥是醫家最常用的中藥之一。蒼術發揮治療疾病的作用與其所含的化學成分有關。故確定中藥蒼術所含化學成分組成對于該藥作用機制的闡明以及臨床應用都是有益的。傳統的中藥蒼術化學成分研究多是采用GC-MS測定蒼術醇提液的化學成分的方式進行[5-10]。然而，中藥蒼術多是以水煎劑的形式給藥的。在多種中藥復方中如黃柏蒼術湯、麻黃蒼術湯、秦艽蒼術湯等幾種中藥復方中都含有該藥[11-14]。國家藥監局進一步提出了標準煎劑的概念，并制定了標準煎劑的質量評價標準。水煎劑與醇提液的化學成分組成有較大的差異。水煎劑中還含有多糖等大量水溶性雜質。這些雜質不僅干擾藥效物質的測定，而且還會降低分析方法的靈敏度。故尋找一種適用于中藥蒼術水煎液中化學成分鑒定的方法就顯得較為重要了。

整體柱是一種由有機或無機聚合方法在空柱中進行原位聚合的連續棒狀整體材料[15]。與常規的填充型萃取柱相比，整體柱制備簡單，可避免繁瑣復雜的填裝色譜柱過程；整體柱含有特殊的孔結構，滲透性良好，傳質阻力小，可提高萃取效率[16]；還可通過選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、凈化[17]。故本文探索將整體柱技術應用于中藥蒼術化學成分分析鑒定研究，結合GC-MS對中藥蒼術的化學成分進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 7890A-7975C GC-MS聯用儀（美國）；BSA124S型十萬分之一電子天平（賽多利斯股份公司）；循環水式真空泵（上海翔雅儀器設備有限公司）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KX-1740QT型超聲波清洗器（深圳市科璽化工有限公司）；TGL-16M離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.2 材料 甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）、甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）、偶氮二異丁腈（AIBN）、環己醇和十二醇購自阿拉丁生化技術公司。正己烷、甲醇（色譜純，山東博城化學有限公司）；水為超純水，其他試劑均為國產分析純。蒼術（河北安國藥材市場）經天津醫科大學藥學院唐鋮副教授鑒定為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea的干燥根莖。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制 精密稱取β-桉葉醇標準品適量，用正己烷溶解，定容至5 mL，搖勻，即得50μg/mL標準溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制 稱取適量蒼術藥材，粉碎，精密稱取5 g粉末加入水50 mL，煎煮1.5 h，冷卻至室溫后補足失重，置于4℃保存備用。

1.3.3 整體柱的制備與表征 采用熱引發聚合的方法在注射器中制備整體柱，聚合過程如下：將單體GMA、交聯劑EDMA、致孔劑環己醇和十二醇、引發劑AIBN按照配比制成預聚溶液，加入離心管中超聲混勻，然后通氮氣10 min，將拔掉針頭的注射器經脫氣后抽取預聚溶液，封口后超聲混勻10 min，60℃水浴聚合12 h，即得聚合物整體柱。反應結束后甲醇和水沖洗整體柱，除去未反應的單體和致孔劑。然后注入正丁胺，封閉整體柱兩端，55℃水浴12 h。修飾完成后，分別用甲醇和水沖洗整體柱。在4 000~400 cm-1范圍內獲得FT-IR光譜，以觀察疏水整體柱的官能團。

1.3.4 整體柱固相萃取分析蒼術化學成分 將水煎液加入所制備整體柱，然后依次采用水、80%甲醇溶液作為洗脫液，收集的80%甲醇溶液洗脫部分，濃縮至干，正己烷重溶后進樣分析。

1.3.5 傳統方法分析蒼術化學成分 采用正己烷萃取蒼術水煎液化學成分，萃取液經微孔濾膜過濾后進樣分析。

1.3.6 GC-MS分析條件 色譜條件：HP-5MS（30 mm×0.25 mm，0.25μm）毛細管柱，程序升溫：柱初始溫度為70℃，以15℃/min升至255℃，保留10 min，再以15℃/min升至270℃。進樣量1μL，維持10 min；溶劑延遲3 min；分流比為50∶1；氣化室溫度為250℃；載氣為高純度He（99.999%）。質譜條件：EI離子源；離子源溫度為230℃；電離能量為70 eV；四極桿溫度為150℃；EM電壓2 165 V；接口溫度為280℃；掃描質量范圍m/z 100～650。

1.3.7 定性和定量 應用NIST 8.0譜庫檢索，并逐個解析各色譜峰相應的質譜圖，對基峰、質荷比以及相對豐度等與標準圖譜比較、鑒定。定量用峰面積歸一化法計算各化學成分在揮發油中的相對百分含量。

2 結果

2.1 疏水整體柱制備及表征 為了獲得具有良好滲透性和機械穩定性的整體柱，對不同聚合物整體柱進行柱背壓試驗，考察單體/致孔劑比例及致孔劑比例兩個參數的影響。

2.1.1 十二醇含量 隨著十二醇的增加，柱體內大孔的比例增加，導致柱壓逐漸下降，滲透性和機械穩定性增加（表1）。此外，當十二醇的用量達到7%時，整體柱滲透性較差。當十二醇含量為10%時，整體柱柱背壓低、滲透性和機械穩定性良好。

2.1.2 致孔劑配比 如表1所示，隨著致孔劑總用量比的增加，整體柱材料孔隙率增多，結構疏松，使得整體柱的柱壓下降，滲透性增加。綜合考慮機械穩定性和滲透性等參數，選擇9∶1（環己醇：十二醇）和1∶3（v/v）的單體與致孔劑的混合比例作為合適的配比。

表1 疏水整體柱的聚合參數Tab 1 Synthesisparameterson thehydrophobic monolithic column

2.1.3 疏水整體柱的表征 通過FT-IR表征得到的整體柱如圖1所示。1 612 cm-1處易識別的峰較弱，對應于甲基丙烯酸縮水甘油酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯的雙鍵聚合。在1 730 cm-1處的峰值是制備的整體柱中乙二醇-二甲基丙烯酸酯雜化物C=O鍵的特征吸收。3 422 cm-1處的N-H峰表明正丁胺成功修飾聚GMA-EDMA（甲基丙烯酸縮水甘油酯-甲基丙烯酸乙二醇酯）整體柱。

圖1 疏水整體柱的紅外光譜Fig 1 Infrared spectrum of hydrophobic monolithic column

2.2 整體柱固相萃取結合GC-MS分析方法學考察

2.2.1 精密度試驗 取50μg/mL的β-桉葉醇標準品溶液，按“1.3.5”GC-MS條件進行分析，連續進樣6次，結果顯示，β-桉葉醇的相對標準偏差（RSD）為1.08%。

2.2.2 重復性試驗 取同一批整體柱，按“1.3.4”項下方法平行萃取制備5份供試品溶液，按“1.3.5”項下GC-MS條件進樣測定，記錄峰面積，計算得到樣品中β-桉葉醇的平均含量為35.26μg/mL，RSD為1.66%，表明該方法重現性良好。

2.2.3 加標回收率試驗 對經過預處理樣品中的β-桉葉醇進行加標回收率測定，按照相當于供試品中成分含量的80%、100%、120%比例加入β-桉葉醇對照品，按“1.3.4”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.5”項下GC-MS條件進樣測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率，結果見表2。β-桉葉醇加樣回收率在93.23%～104.52%，RSD為2.91%（n=9），表明該方法準確性良好。

2.3 蒼術化學成分分析 應用GC-MS對整體柱固相萃取后的蒼術水煎液樣品進行分析，以面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，結合質譜計算機軟件、NIST 8.0質譜庫和文獻資料共同分析，鑒定結果見表2。

表2 蒼術的化學成分Tab 2 Thecomponentsof Atractylodeslancea

2.4 與傳統分析方法對比 應用GC-MS分別對傳統的正己烷萃取法及整體柱固相萃取后的蒼術水煎液樣品進行分析，得到總離子流圖，見圖2。從圖中可以看出，傳統方法水煎液所得到的色譜響應值（圖2A）低于固相萃取法（圖2B）。

圖2 蒼術水煎液總離子流圖Fig 2 Total ion current chromatogram of Atractylodes lancea decoction

3 討論

中藥水煎劑是傳統中醫臨床用藥的主流，水煎煮也更接近服用藥物的真實情況。在臨床治療過程中，蒼術常被制成黃柏蒼術湯、麻黃蒼術湯、秦艽蒼術湯等經典名方，且這些經典方劑大多以水煎劑的形式應用于臨床[11-14]。研究蒼術水煎液中的主要化學成分對于該類方劑的研究也是較為重要的。然而水煎劑中水溶性雜質較多，不僅影響對化學成分鑒定的準確性，還影響色譜的分離度。故本文以GMA為單體，EDMA為交聯劑，環己醇和十二醇為致孔劑，AIBN為氧化還原引發體系，通過正丁胺修飾成功制備了滲透性良好的聚（GMA-EDMA-正丁胺）疏水整體柱。據報道蒼術主要的有效成分是由倍半萜類和聚乙烯炔類等化學成分組成[6]，該類化學成分具有降血糖、抗凋亡、抗氧化、抗腫瘤、抗炎等活性。而蒼術傳統水煎液中不僅包含此類化學成分，還包含多糖等水溶性的化學成分。這些雜質不僅干擾藥效物質的測定，而且還會降低分析方法的靈敏度。故在本研究中建立并采用整體柱固相萃取蒼術水煎液中化學成分。采用整體柱固相萃取可避免蒼術水煎液中水溶性雜質對分析的干擾，結合GC-MS聯用技術可對蒼術水煎液的化學成分進行鑒定。β-桉葉醇等半萜類化學成分常被用于蒼術的質量控制研究[18-19]。故本文也采用該化學成分進行方法學考察。結果表明該方法具有較好的精密度和準確度。

在洗脫溶劑的選擇方面，在研究中比較了10%、50%、80%的甲醇。通過GC-MS的分析表明80%的甲醇可較完全的將蒼術中的化學成分洗脫下來。故在后續研究中，采用該比例的甲醇進行洗脫；在GC-MS分析條件方面，本文考察了不同的分流比。隨著分流比增大，GC-MS圖譜的檢出成分減少，分流比越小GC-MS檢出成分越多，但定性分析發現，分流比較小時蒼術GC-MS圖譜中有少量柱流失物色譜峰。因此，綜合色譜峰檢出情況，實驗選擇分流比50∶1。

總之，本文制備并應用整體柱結合GC-MS分析對蒼術水煎液中化學成分進行了鑒定。該方法操作簡單、穩定性高、重復性好，回收率高，可為中藥蒼術水煎劑的整體質量評價與控制提供新思路。