白細胞介素-18在小鼠缺血性腦卒中的損傷作用及其機制

烏日吉木斯，劉嘯軒，蘇悅，閻濤，2

（天津醫科大學總醫院1.神經病學研究所；2.神經內科，天津300052）

腦卒中是我國第一位死亡原因，具有高發病率、高復發率、高致殘率、高死亡率的特點，顯著增加了患者家庭和社會的經濟負擔。腦卒中的療法主要集中于局部缺血區域神經元的保護和血流再通，但因為其治療時間窗窄和技術要求高，只有極少數患者能夠受益。卒中后組織損傷引發的免疫炎癥反應貫穿卒中后各個階段，如何通過干預免疫炎癥以減輕腦卒中患者的腦損傷而改善預后，是未來卒中研究的重點方向之一[1]。白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）是一種多效性促炎細胞因子，也被稱為干擾素γ誘導因子，能夠被半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteine-requiring aspartate protease，caspase-1）激活成為成熟有活性的糖蛋白，在固有免疫和獲得性免疫中起關鍵作用，在人體各種免疫細胞中均有廣泛表達[2]。研究表明，IL-18參與多種神經系統疾病，包括視神經脊髓炎譜系疾病、多發性硬化、腦內出血等[3-4]。然而，尚不明確IL-18在缺血性腦卒中的作用機制。因此，本研究通過光化學法誘導局灶性大腦皮層缺血性腦卒中模型，探討IL-18在缺血性腦卒中的損傷作用及其機制，對將來臨床治療缺血性腦卒中提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性C57BL/6J小鼠，20~22 g，7~8周齡；購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物[許可證號：SCXK（京）2016-0006，批號：110011200109844553]全部飼養于天津醫科大學總醫院神經病學研究所動物實驗中心SPF級專業鼠房。小鼠隨機分為對照組、腦梗死組、IL-18分泌型結合蛋白（IL-18BP）治療組（IL-18BP是一種分泌的糖蛋白，通過與IL-18結合并阻斷其生物學活性而充當IL-18拮抗劑，購自美國R&D公司），每組18只。IL-18BP治療組在造模后1 h、24 h及48 h腹腔注射IL-18BP（4μg/次），而對照組和腦梗死組分別注射等量的生理鹽水。所有小鼠提供充足的食物和水，并維持晝夜節律的穩定。

1.2 實驗方法

1.2.1 缺血性腦卒中模型 本實驗采用光化學法誘導局灶性大腦皮層缺血性腦卒中模型。主要步驟：稱重小鼠，在手術前5 min行腹腔注射給予玫瑰紅染料（50 mg/kg，0.9%生理鹽水溶解，光敏感物質，可在綠光誘導下誘導特定區域的血管阻塞）。腹腔注射5%水合氯醛（70μL/10 g）麻醉小鼠，之后將麻醉好的小鼠固定于立體定位儀上，下方需放置小鼠體溫維持板用以維持體溫，紅霉素眼藥膏涂抹小鼠雙眼予以保護。沿顱骨中縫切開小鼠顱骨表面皮膚，約1cm，充分暴露小鼠顱骨表面，利用棉簽清除所需要誘導梗塞部位的顱骨外骨膜并標記。將綠光光源的光纖頭部固定于標記部位，在光纖頭部與小鼠顱骨間放置中空的黑色橡膠墊來防止光線露出。開啟綠光光源照射20 min，期間注意小鼠生命體征。照射結束后取下光纖頭部，生理鹽水沖洗顱骨表面，縫合切口，利用碘伏再次對縫合傷口消毒，維持小鼠體溫至徹底清醒，恢復自由進食水。

1.2.2 動物處理 分別于第3天和第14天處死小鼠，深度麻醉小鼠后進行冰磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）心臟灌注，后取出腦組織。第14天的腦組織制成石蠟標本，進行后續染色。第3天的腦組織，分別用于RNA提取和流式細胞術檢測。

1.2.3 神經功能評分 采用改良神經功能缺損量表評分（modified neurological severity score，mNSS）和足錯步實驗（foot-fault test），通過評價其運動功能以及感覺功能，判斷缺血性腦損傷后損傷程度和恢復情況。分別于造模后第1、3、7、14天進行神經功能評分。

1.2.4 蘇木紫和伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色 小鼠腦組織保存于4%組織固定液中固定24 h后，進行后續脫水石蠟包埋后制備成石蠟切片。腦切片行HE染色，測量腦梗死面積大小。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測炎性指標 使用實時熒光定量PCR技術檢測IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6和IL-10的表達水平。在第3天處死小鼠，取新鮮腦組織，加入TRIzol裂解液，研碎充分，制備RNA，檢測其濃度及純度保證在可用范圍內。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成引物。引物濃度稀釋至10μmol/L。20μL的反應體系由2.5μL的cDNA、1μL的正向引物、1μL的反向引物、5.5μL的無酶水和10μL的SYBR green PCR Master Mix組成。在Option 2Real-Time PCR檢測系統進行定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.6 流式細胞術 在造模后第3天處死小鼠，收集腦組織以制備單細胞懸液。將腦組織在冰冷的PBS中切成小塊。將組織碎片與膠原酶D4（1 g/L，Sigma-Aldrich）和Dispase（1 g/L，Roche）孵育，并在37℃消化60 min。使勻漿通過70μm過濾器，并將濾液以2 000 r/min離心3 min。離心的細胞重懸于30%Percoll（GE）中，然后以700 r/min離心10 min。用冰PBS以2 000 r/min洗滌沉淀10 min。將單細胞懸液與以下熒光標記的抗體孵育：分別孵育CD45、CD11b、CD86和CD206抗體。其中，CD45+CD11b+CD86+標記M1型小膠質細胞，CD45+CD11b+CD206+標記M2型小膠質細胞。流式細胞儀數據從FACSAria流式細胞儀（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）收集，并使用Flowjo_V 10進行分析。

1.3 統計學處理 利用Graphpad Prism5.0進行統計分析，以±sx表示結果。兩組獨立樣本比較采用非配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腦梗死后神經功能情況 與腦梗死組比較，在第7天和14天，IL-18BP治療組小鼠mNSS評分顯著降低（t=2.750，P<0.05；t=3.789，P<0.05），見圖1。與腦梗死組比較，在造模后的第3、7、14天，IL-18BP治療組小鼠的足錯步實驗評分顯著降低（t=2.518，P<0.05；t=2.767，P<0.05；t=3.114，P<0.05），見圖1。

2.2 各組腦梗死面積情況 與腦梗死組比較，IL-18BP治療組腦梗死面積顯著降低（t=2.235，P<0.05），見圖2。

圖2 HE染色檢測小鼠腦梗死面積Fig 2 Theinfarct sizedetected by HE staining

2.3 各組小鼠腦組織中炎性因子的表達 與對照組比較，腦梗死組小鼠腦組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平升高（t=4.289，P<0.05；t=3.276，P<0.05；t=3.687，P<0.05），IL-10的水平降低（t=3.134，P<0.05），見圖3。而與腦梗死組比較，IL-18BP治療組小鼠腦組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著降低（t=3.091，P<0.05；t=2.328，P<0.05；t=3.443，P<0.05），IL-10的水平顯著升高（t=4.997，P<0.05），見圖3。

圖3 小鼠腦組織內炎性因子表達變化Fig 3 Thechangeof inflammatory factorsin brain tissueof mice

2.4 各組小鼠腦組織內小膠質細胞表型變化 與對照組比較，腦梗死組M1型小膠質細胞數量顯著增加（t=5.971，P<0.05），M2型小膠質細胞數量增加（t=2.823，P<0.05）。與腦梗死組比較，IL-18BP治療組M1型小膠質細胞數量明顯降低（t=4.779，P<0.05），M2型小膠質細胞數量明顯升高（t=2.619，P<0.05）。

圖4 流式細胞術檢測各組小鼠腦組織M 1/M2型小膠質細胞的變化Fig 4 Thechangesof M1/M2 typemicroglia in thebrain tissueof micedetected by flow cytometry

3 討論

卒中導致神經元細胞死亡，并激活損傷相關的分子模式，釋放的因子在受傷的大腦區域引起局部炎癥[5-6]。這種局灶性大腦炎癥會加劇血-腦屏障損害、微血管衰竭、腦水腫、氧化應激并直接導致神經元細胞死亡，從而加劇繼發性腦損傷[1]。IL-18在缺血性腦損傷中發揮重要作用，參與炎癥反應的啟動與擴增。IL-18啟動的單核細胞中促炎因子和趨化因子可介導免疫細胞向缺血損傷部位募集，觸發炎癥級聯反應，加劇缺血后的損傷[7]。IL-18 mRNA在成年大鼠腦缺血后的晚期被誘導[8]，參與腦卒中后腦內炎癥的誘導和發展[9]。在腦卒中患者中，血清IL-18水平升高與顱腦計算機斷層掃描中低密度區域的范圍以及功能障礙相關[3]。研究表明用抗IL-18單克隆抗體或IL-18BP可改善缺血再灌注引起的心肌損傷[10-11]。本研究通過光化學法誘導局灶性大腦皮層缺血性腦卒中模型，應用IL-18BP阻斷IL-18作用并評估神經功能及腦梗死面積變化。結果顯示，IL-18BP治療腦梗死小鼠后不僅能改善小鼠神經功能障礙，還能顯著降低腦梗死面積。

卒中后大腦中多種細胞類型可產生炎性介質，包括細胞因子和趨化因子。細胞因子是中樞神經系統各種病理條件下神經炎癥和急性、慢性神經退行性變的重要介質。在急性缺血性卒中的小鼠模型中，缺血后急性期在對側半球中觀察到的一系列細胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α和轉化生長因子-β，是各種神經病理條件下神經炎癥的重要介質[1，6]。對腦出血發作后2 h至5 d死亡的30例腦出血患者的大腦進行組織病理學病例對照研究，發現對側海馬中的核因子-κBp65亞基、巨噬細胞炎性蛋白2和基質金屬蛋白酶-9上調[1]。因此細胞因子介導的神經炎癥與神經元細胞死亡和不良結果相關。研究表明，腹腔注射IL-18BP可改善炎癥反應，促進血管再生修復[12]。本研究應用IL-18BP阻斷IL-18作用，實時熒光定量PCR檢測腦組織中炎性因子表達。發現IL-18BP治療腦梗死小鼠可通過降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平，增加抗炎因子IL-10的表達，從而改善卒中后的神經功能損傷。

小膠質細胞是腦內表達炎癥體基因的主要細胞，占中樞神經系統細胞的10%~15%[13-14]。活化的小膠質細胞/巨噬細胞由于其M1/M2表型不同，在腦卒中后神經損傷中發揮著雙刃劍的作用[15]。通常被認為具有神經毒性的M1型小膠質細胞表達促炎因子，具有清除死細胞和組織碎片的功能[16]；而被認為具有神經保護和修復作用的M2型小膠質細胞主要表達抗炎和生長因子，修復受損的腦組織[17-18]。血-腦屏障破壞也可能與小膠質細胞的激活狀態密切相關。有實驗已經顯示腦卒中后，炎癥性小膠質細胞通過上調包括IL-1β、TNF-α和IL-6在內的促炎性細胞因子而大大降低了血-腦屏障的完整性[19]。小膠質細胞還可以與星形膠質細胞或腦微血管內皮細胞相互作用?；罨男∧z質細胞通過直接吞噬內皮細胞并引起血管解體，最終導致血-腦屏障的破壞，進一步引入循環免疫細胞并增加其對腦實質的浸潤[20]。本研究應用IL-18BP阻斷IL-18作用，應用流式細胞術檢測腦組織中小膠質細胞表型變化，發現IL-18BP治療腦梗死小鼠后可通過促進小膠質細胞表型由促炎表型M1向抗炎表型M2轉化，從而減少促炎因子的分泌，增加抗炎因子的分泌，改善卒中后的炎癥反應。但其具體影響的信號通路尚未明確，有待今后進一步完善。

綜上所述，缺血性腦卒中后IL-18介導了免疫反應從而引起卒中后的繼發性免疫炎性損傷。IL-18主要通過介導小膠質細胞從促炎表型向抗炎表型轉化，影響腦卒中后神經功能的恢復。本研究揭示了IL-18在腦卒中的免疫炎性損傷中發揮關鍵的調節作用，為臨床腦梗死救治提供新的視角和治療方法。