基于網絡藥理學、分子對接及實驗探討茵陳蒿湯調節阻塞性黃疸氧化應激的作用機制

陳帥，劉軍艦，尚海濤，張井虹，李忠廉

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市中西醫結合醫院肝膽胰第二外科，天津300100）

阻塞性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是指由膽道內或膽道鄰近部位的良、惡性病變阻礙膽汁經由膽道流入十二指腸引發膽道內壓力增高，膽汁由肝細胞和毛細膽管逆流入血竇、竇周，使血中結合膽紅素水平升高引起的黃疸[1]。阻塞性黃疸可以引起機體發生炎癥、內毒素血癥、肝臟血流動力學改變、氧自由基增多等，從而造成肝損傷[2-3]。目前利用外科手段積極處理病因是西醫治療的首要方法，但中藥方劑對保守治療、術前減黃及解除梗阻后加快黃疸消退、改善肝功能有較大作用[4]。茵陳蒿湯由茵陳、大黃、梔子三味藥組成，是治療濕熱黃疸的常用方。氧化應激是肝損傷病理過程中的一個重要因素，眾多研究證實茵陳蒿湯可以改善OJ引起的肝損傷，但對其作用機制缺乏系統的研究。網絡藥理學能夠系統觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，這與復方中藥多成分、多途徑和多靶點協同作用的原理殊途同歸[5]。

1 材料與方法

1.1 茵陳蒿湯的有效成分及靶點的收集與篩選 通過TCMSP數據庫搜索茵陳蒿湯中藥物（茵陳、大黃、梔子）的化學成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選標準，得到茵陳蒿湯的有效化學成分及其對應的靶點蛋白。

1.2 疾病靶點獲取 通過Gene Cards數據庫檢索關鍵詞“obstructive jaundice”，得到OJ的相關靶點。

1.3 茵陳蒿湯和OJ的靶點交集 運用Excel中VLOOKUP函數以及UniProt數據庫對茵陳蒿湯中化學成分的靶點蛋白的基因名稱進一步規范。利用R4.0.2軟件將茵陳蒿湯的作用靶點與OJ的靶點進行交集分析，獲得茵陳蒿湯和OJ的交集靶點，并繪制Venny圖。并通過Cytoscape軟件，對茵陳蒿湯中有效成分和交集靶點進行拓撲屬性分析。

1.4 交集靶點蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網絡構建 將交集靶點導入STRING數據庫，將蛋白種屬設置為“Homo sapiens”，去除孤立的靶點蛋白，其余參數均保持默認，獲得茵陳蒿湯與OJ交集靶點的蛋白相互作用關系網絡數據。通過Cytoscape軟件進行網絡可視化及網絡拓撲屬性分析。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析 將Bioconductor數據庫導入R軟件，利用R軟件對茵陳蒿湯與OJ的交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將其結果繪制成柱狀圖與氣泡圖進行可視化。

1.6 分子對接驗證 從TCMSP數據庫中導出茵陳蒿湯主要成分的分子結構，保存為mol2格式，利用Autodock Tools4.2.6軟件調整電荷、判定配體的root、選擇配體可扭轉的鍵，并保存為pdbqt格式。從PDB數據庫中獲得eNOS和iNOS的蛋白結構，通過PyMol2.4.1軟件去除水分子及原配體，然后利用Autodock Tools給蛋白加氫、計算電荷、添加原子類型，并保存為pdbqt格式。再通過Autodock Tools獲得活性位點中心及盒子大小等對接信息，默認設置為energy_range=3，exhaustiveness=100。最后運用Autodock-vina1.1.2執行分子對接計算，通過PyMol軟件實現對接結果可視化，建立分子對接模式圖。

1.7 免疫組化實驗驗證

1.7.1 藥材、試劑 依據《傷寒論》中茵陳蒿湯劑量組成折合：茵陳180 g，梔子150 g，大黃60 g，共計390 g中藥購于天津市南開醫院中藥制劑室，取2次煎煮液濃縮至390 mL，每mL含生藥量1 g。

免疫組化試劑：4%多聚甲醛、多聚賴氨酸、抗原修復液、山羊血清封閉液、一抗：NOS3（A-9）:sc-376751，NOS2（C-11）:sc-7271（購自SANTA CRUZ生物公司）；二抗：IgG；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB顯色試劑盒；蘇木素等。

1.7.2 動物模型制備及分組給藥 成年Sprauge-Dawley（SD）大鼠36只，體重200～230 g，雄性，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（實驗動物使用許可證號：SCXK京2014-0004；動物倫理委員會通過編號：NKYY-DWLL-2019-081）。應用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（A組）、模型組（B組）、茵陳蒿湯組（C組），每組12只。B組和C組于大鼠膽總管中上1/3行雙重結扎，手術3 d后觀察大鼠小便顏色變黃即說明OJ模型建立成功。A組游離上段膽總管后關腹。大鼠自建模后第3天起C組每日給予茵陳蒿湯劑3.6 mL/kg（相當于生藥1 g/mL）灌胃，A組和B組每日給予等量生理鹽水灌胃。于術后10 d處死大鼠，并留取肝組織進行IHC檢測。

1.7.3 免疫組化 取A組、B組、C組大鼠肝組織，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗，取少量組織塊；用4%多聚甲醛進行固定，多級脫水、包埋成石蠟組織塊，按5μm切片，附于經多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜；將切片經二甲苯及多級乙醇脫蠟；放入抗原修復液、正常山羊血清封閉液，進行eNOS及iNOS免疫組化，最后加入DAB試劑和蘇木素染色，顯微鏡下觀察，進行400×的顯微照相，選擇有意義的組織相進一步分析。

1.7.4 統計學處理 實驗結果采用SPSS26.0軟件進行分析，采用單因素方差分析進行多組間比較，且符合方差齊性就采用LSD檢驗方法，實驗結果以±s及柱狀圖表示，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 茵陳蒿湯有效成分篩選 通過在TCMSP數據庫中檢索，根據OB≥30%、DL≥0.18的標準進行篩選，獲得44個有效成分。茵陳、大黃、梔子分別篩選到13、16、15種有效成分（表1），其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）為茵陳、大黃、梔子三者的共有成分，槲皮素（quercetin）為茵陳和梔子的共有成分。

表1 茵陳蒿湯主要有效成分及相關參數Tab 1 Main effectivecomponentsand related parametersof Yinchenhao Decoction

2.2 茵陳蒿湯和OJ的靶點交集分析 將茵陳蒿湯中41個化學成分及其對應的靶點蛋白，運用Excel中VLOOKUP函數以及UniProt數據庫剔除重復項并規范基因名稱，得到29個化學成分及對應的177個靶點。通過在GeneCards數據庫中檢索OJ相關靶點，共得到2 183個疾病相關靶點。將茵陳蒿湯的作用靶點與OJ的靶點進行交集分析，得到123個交集靶點基因，如圖1。將茵陳蒿湯化學成分和交集靶點導入Cytoscape軟件進行網絡拓撲屬性分析，篩選出前5個主要化合成分，見表2。

表2 前5個與交集靶點對應的主要化合物Tab 2 The first five main compounds corresponding to the intersection targets

圖1 茵陳蒿湯和OJ的交集靶點韋恩圖Fig 1 Venny diagram of intersection target of Yinchenhao Decoction and OJ

2.3 交集靶點PPI網絡構建 將交集靶點導入STRING數據庫，獲取蛋白互作信息（其中有1個蛋白未參與互作）。將蛋白互作信息導入到Cytoscape軟件進行網絡拓撲屬性分析，得到茵陳蒿湯和OJ交集靶點PPI網絡（圖2）。在PPI網絡中，一個節點的度（Degree）表示網絡中和節點相連的路線條數，該網絡由122個節點組成，其中節點的大小與Degree成正比，Degree越大顏色越紅，表示靶點作用途徑更多。根據節點的Degree繪制出前15個關鍵靶點的條形圖（圖3）。

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析 為進一步探討茵陳蒿湯作用于OJ的機制，對交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析。根據P＜0.05，確定了135個GO條目和162個KEGG通路，分別將靶點富集個數前20的GO條目和KEGG通路繪制成條形圖（圖4）和氣泡圖（圖5），并利用Cytoscape軟件繪制主要通路-靶點-化合物的網絡圖（圖6）。通過對圖6分析發現靶點蛋白NOS3和NOS2參與氧化應激過程中的多條通路，并與茵陳蒿湯中多個化合物有關（圖7）。

圖4 茵陳蒿湯治療OJ作用靶點的GO富集條形圖Fig 4 Bar graph of GO enrichment of targetsof Yinchenhao Decoction in thetreatment of OJ

圖5 茵陳蒿湯治療OJ作用靶點的KEGG富集氣泡圖Fig 5 Bubblechart of KEGG enrichment of targetsof Yinchenhao Decoction in thetreatment of OJ

圖6 主要通路-靶點-化合物網絡Fig 6 Main pathway-target-compound network

圖7 NOS2、NOS3相關化合物及通路網絡Fig 7 Network of compoundsand pathwaysrelated to NOS2 and NOS3

2.5 分子對接驗證 通過Autodock_vina軟件將目的蛋白NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）分別與槲皮素、山奈酚、異鼠李素進行分子對接。分子對接結果示eNOS和iNOS與槲皮素、山奈酚、異鼠李素的最低結合能均<-5.0 kcal/mol（表3），且分子對接模式圖中這些化學成分與eNOS和iNOS蛋白上多個氨基酸殘基相結合（圖8）。

圖8 eNOS和iNOS與主要化合物的分子對接模式圖Fig 8 Molecular docking patternsof eNOSand iNOSwith major compounds

表3 eNOS和iNOS與主要化合物的最低結合能（kcal/mol）Tab 3 The lowest binding energies of eNOSand iNOSwith major compounds（kcal/mol）

2.6 茵陳蒿湯對大鼠肝組織中NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）蛋白表達的影響 IHC結果顯示：與假手術組相比，模型組肝組織中eNOS平均光密度值降低，而iNOS平均光密度值升高（P＜0.05）；與模型組相比，茵陳蒿湯組肝組織中eNOS平均光密度值升高，iNOS平均光密度值降低（P＜0.01），見圖9、10。

圖9 各組大鼠肝組織中eNOS和iNOS表達（免疫組化，400×）Fig 9 Expression of eNOSand iNOSin liver tissueof ratsin each group（IHC，400×）

圖10 各組大鼠肝組織中eNOS、iNOS蛋白平均光密度值比較（±s）Fig 10 Comparison of the AODof eNOSand iNOSproteinsin liver tissueof ratsin each group（±s）

3 討論

中醫認為黃疸發病有濕、熱、寒、血瘀、脾虛等多種不同的病機，其中以濕邪為主。辨證分型以濕熱蘊結為常見，治療均以化濕邪、利小便為治療大法，對癥選用清熱利濕、溫中補虛、化瘀等治法[6]。茵陳蒿湯由茵陳、大黃、梔子三味藥組成，方中重用茵陳為君藥，以其善能清熱利濕退黃，為治黃疸之主藥。臣以梔子清熱降火，通利三焦，助茵陳引濕熱從小便而去。佐以大黃瀉熱逐瘀，通利大便，導瘀熱由大便而下。三藥合用，以利濕與泄熱相伍，使二便通利，前后分消，濕熱得行，瘀熱得下，則黃疸自退。

本研究通過網絡藥理學方法，獲得茵陳蒿湯的41種有效化學成分，經過篩選規范，共收集到29個有效化學成分及對應的177個靶點，并對這些有效成分及靶點進行分析。槲皮素的作用靶點最多，它也是茵陳、梔子共有的化學成分；其次是山奈酚，以及異鼠李素、蘆薈大黃素、β-谷甾醇等。研究表明，槲皮素是一種黃酮類化合物，具有多重生物活性，如抗氧化、抗炎、減輕肝毒性、預防肝纖維化等作用[7-8]。山奈酚是一種黃酮類化合物，通過發揮抗炎和抗氧化作用，在各種化學誘導的肝損傷模型中發揮保護作用[9]。另外，山奈酚可以降低谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）水平，減輕肝細胞損傷和凋亡[10]。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤等方面表現出良好的藥理作用[11]。此外，現代藥理研究表明，茵陳蒿湯的茵陳色原酮、Artepillin A、蘆薈大黃素等成分具有促進膽汁分泌和排泄的作用[11]。通過藥物與疾病靶點交集得到123個交集靶點。其中蛋白激酶B（Akt）1、TP53、白細胞介素（IL）-6、血管內皮生長因子（VEGF）A、CASP3、腫瘤壞死因子（TNF）、Jun、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）8是關鍵靶點蛋白。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與PI3K、EGFR等多個通路，在炎癥、細胞增殖、遷移和纖維形成的肝損傷過程中起著獨特的作用[13]。IL-6是一種多功能細胞因子，可以激活多種細胞內信號通路，在肝細胞凋亡、抗炎、氧化應激中起著重要作用[14-15]。VEGFA是具有高度內皮細胞特異性的有絲分裂原，在血管發生和形成過程中起著主要的調控作用。VEGF的表達可以促進血管形成，在肝臟再生和肝損傷的修復中起著重要作用[16]。

通過對交集靶點的GO富集結果分析，預測茵陳蒿湯治療OJ可能涉及DNA結合轉錄因子結合、信號受體激活劑活性、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、氧化還原酶活性等生物過程。通過KEGG通路富集分析，發現茵陳蒿湯中多種成可以通過Hepatitis B、流體剪應力與動脈粥樣硬化、MAPK、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子、IL-17、肝細胞癌、低氧誘導因子1（HIF-1）等信號通路作用于OJ。MAPK是生物體內重要的信號轉導系統之一，參與介導細胞生長、分裂、分化、死亡以及細胞間的功能同步等多種生理過程。其中c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路是MAPK中重要的通路之一，Wang等[17]發現大黃酸誘導的活性氧簇（ROS）激活了JNK/Jun/caspase-3信號通路，進而誘導肝癌細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路是細胞內抑制細胞凋亡的關鍵性信號轉導通路。研究證明，PI3K/Akt通路激活可以抑制氧化應激、炎癥和細胞凋亡，對肝損傷具有保護作用[18]。HIF-1是低氧濃度或缺氧應答中關鍵的轉錄因子，通過激活下游靶基因，參與細胞的增殖、凋亡、血管生成、能量代謝等環節。研究發現蕨麻多酚可能在血管內皮細胞缺氧時通過下調HIF-1α，進而抑制內皮素（ET）-1的合成和分泌；上調eNOS，下調iNOS，調控一氧化氮（NO）的合成和分泌;調節NO和ET-1的動態平衡，發揮抗缺氧保護作用[19]。上述研究，體現了茵陳蒿湯多成分、多靶點的特點，其可能通過促進膽汁分泌排泄、抗炎、抑制肝纖維化、抗氧化、減輕肝細胞損傷和凋亡等多個生物過程及作用通路，起到治療OJ的作用。

通過對KEGG富集結果分析發現，靶點蛋白NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）參與流體剪應力與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt、HIF-1等多條通路，并與茵陳蒿湯中多個化合物有關，因此將eNOS和iNOS作為目的蛋白進行分子對接和免疫組化實驗驗證。兩者均是合成NO的關鍵酶，NO在OJ肝損害中具有雙重作用。在疾病發展早期，機體NO水平相對較低，可擴張血管，抑制血小板聚集，改善肝臟血流；NO還具有抗氧化作用，可以與超氧陰離子等自由基結合，產生低毒性自由基，減輕肝損傷。隨著疾病的發展，內毒素等各種刺激因子引起iNOS表達增加，生成大量的NO，過量的NO具有細胞毒性，加重肝損傷[20]。上述結果表明茵陳蒿湯中與交集靶點有關的化學成分主要有槲皮素、山奈酚、異鼠李素等，因此將eNOS和iNOS蛋白分別與這些化學成分進行分子對接，發現對接的最低結合能均≤-5.0 kcal/mol，且通過分子對接模式圖可知這些化學成分可能與蛋白上多個氨基酸殘基相結合，表示eNOS、iNOS和茵陳蒿湯中的主要化合物槲皮素、山奈酚、異鼠李素有較好的結合能力。通過對大鼠肝組織免疫組織化學研究發現，與假手術組相比，模型組肝組織中iNOS蛋白表達升高，而eNOS蛋白表達降低；與模型組相比，茵陳蒿湯組肝組織中iNOS蛋白表達降低，eNOS蛋白表達升高。這可能是OJ發生時，機體炎癥和內毒素等刺激因子引起肝組織中iNOS水平迅速增加，產生大量NO，造成肝損傷；而茵陳蒿湯通過調節eNOS和iNOS，從而降低NO的過量表達，維持一定生理量，使其產生抗氧化、改善肝臟微循環的作用。

本研究通過網絡藥理學方法研究茵陳蒿湯治療OJ的有效成分、作用靶點及通路，體現了茵陳蒿湯多成分、多靶點、多途徑的作用特點，系統性分析了茵陳蒿湯治療OJ的可能作用機制，并通過分子對接技術證實茵陳蒿湯中的多種活性成分可作用于eNOS、iNOS蛋白。免疫組化實驗證實茵陳蒿湯對OJ氧化應激的調節可能與改變eNOS、iNOS蛋白的表達有關，這為進一步研究茵陳蒿湯提供了思路和理論依據。