液氮冷凍聯合光動力療法治療男性包皮尖銳濕疣的療效觀察及HPV檢測分析

吳美樂，呂新翔，于希軍，李東霞，馬元龍，賀 偉

（內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚性病科，內蒙古 呼和浩特 010050）

基于5-氨基酮戊酸的光動力療法（photodynamic therapy with 5-aminolaevulinic acid,ALA-PDT）是一種利用光化學反應進行疾病診斷和治療的新技術，其主要的原理是增生活躍的細胞可以大量吸收光敏劑ALA，而正常細胞吸收得很少，在特定光源激發下，導致特定細胞凋亡，進而起到靶向治療作用[1]。無論是最早的病例報道還是病例對照研究的文獻，均報告ALA-PDT在尖銳濕疣的治療有效性、降低復發率方面均有顯著的優勢，并且在清除HPV感染方面也具有突出的效果[2]。為進一步探討光動力治療男性包皮尖銳濕疣的效果及可能的治療機理，選取80例未經治療的男性包皮尖銳濕疣患者，觀察尖銳濕疣的治療效果和復發情況，并在治療前后對患者皮損區域進行HPV基因檢測（HPV6或HPV11），分析其對HPV感染清除的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月～2019年6月就診于本院皮膚性病科門診的男性尖銳濕疣患者作為研究對象（皮損位于包皮部位），經臨床、醋酸白試驗或組織病理確診，并且HPV基因檢測陽性（HPV6或HPV11陽性）。對所有患者在治療前結合病史及檢查化驗進行篩查，排除標準：① 合并其他傳染性疾病（包括其他性傳播疾病）；② 合并免疫功能低下的其他疾病（如HIV感染、糖尿病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、系統使用糖皮質激素或免疫抑制劑、接受放療或化療等）。共有80例符合納入標準的患者，對其進行治療觀察。將所有患者隨機分為兩組，即治療組和對照組，每組各40例。患者年齡（19～65）歲，平均（36.5±12.8）歲。所有患者的皮損直徑＜1cm，皮損數目（3～20）個。治療組先給予冷凍治療一次，次日開始光動力治療，每周1次，連續治療4次。對照組僅選擇冷凍治療，每周1次，連續治療（3～4）次（根據皮損清除情況決定治療次數）。本研究經過內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準（NO.YJ2019073），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 治療方法 光動力治療方法：0.1%新潔爾滅溶液常規消毒皮損區域皮膚后，將用5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid，上海復旦張江生物醫藥股份有限公司）配制成的20%的凝膠，立即均勻涂于疣體及其周邊1cm范圍外觀正常的皮膚黏膜上。涂藥劑量按照38mg/cm2計算，即直徑2cm（3.14cm2）皮膚范圍應用118mg ALA藥物，保鮮膜封包，避光3h。封包結束后，用輸出波長635nm，能量密度（100～120）J/cm2的LD600-A型半導體激光治療機照射（上海復旦張江生物醫藥有限公司提供），每個光斑照射20min。

冷凍治療：常規使用0.1%新潔爾滅溶液消毒皮損區域后，用醫用棉簽蘸取液氮點涂于疣體處，根據疣體大小進行（2～3）個凍融周期。

1.3 復發情況評估及HPV基因檢測實驗方法 所有患者隨訪至第8周末進行療效評估，利用醋酸白試驗觀察疣體復發情況。皮損區域在治療前（基線）和治療后第8周末分別進行HPV基因檢測（HPV6/11）。取材方法：利用無菌取材刷反復刷疣體表面（3～5）次，以取得脫落的角質表皮細胞。治療8周后，利用同樣方法在疣體或原疣體部位進行取材。HPV基因檢測采用商業化的HPV基因分型試劑盒進行檢測（亞能生物技術（深圳）有限公司，深圳），具體實驗步驟按照試劑盒說明進行操作，依次進行HPV-DNA提取、PCR擴增、雜交及結果判斷。

1.4 統計學方法 所有數據利用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計數資料用（%）表示，Fisher's確切概率法檢驗比較兩組間的差異。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

隨訪至第8周末評估結果顯示 治療組40例患者中有35例未見新發疣體（87.5%），未見疣體復發，5例有新疣體復發（12.5%）；對照組40例患者中有22例未見新發疣體（55%），未見疣體復發，18例有新疣體復發（45%）。經統計分析，差異有統計學意義（P＜0.05），患者治療前后復發率比較見表1。

表1 兩組包皮尖銳濕疣復發率及HPV清除率比較（n，%）

4周后療程結束，隨訪至治療后第8周末，對57例無疣體復發的病例（治療組35例、對照組22例）進行了再次HPV基因檢測。檢測結果顯示：治療組中有17例未檢測到HPV6/11（占比48.57%），對照組中有4例未檢測到HPV6/11（占比18.18%）。經統計分析差異有統計學意義（P＜0.05），治療組和對照組HPV清除率比較見表1。

3 討論

尖銳濕疣是一種常見的性傳播疾病，是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染皮膚黏膜導致的疾病，常由HPV6和HPV11型感染導致[1、3]，臨床表現以皮膚黏膜疣狀增生為特征。除了肉眼可見的疣體，尖銳濕疣患者的皮損周圍往往存在亞臨床感染和潛伏感染。亞臨床感染是指皮膚黏膜已經感染HPV，組織發生了病理學變化，但尚未出現肉眼可見的疣體。通過3%～5%冰醋酸外涂（醋酸白試驗）、皮膚鏡檢查或皮膚病理檢查可以發現亞臨床感染，通過分子生物學技術方法檢測HPV。文獻報道正常男性生殖器HPV檢測陽性率在1.3%～72.9%不等，可見HPV的潛伏感染率很高，而且會長期存在。許多患者同時感染多種類型的HPV，包括高危型HPV，因此HPV潛伏感染和亞臨床感染需要更多的關注和治療。有學者利用ALA-PDT治療HPV亞臨床感染和潛伏感染的結果顯示，接受3次ALA-PDT治療后的患者的HPV病毒清除率顯著高于接受1次治療的患者。

同時有研究表明，尖銳濕疣患者的整體免疫功能低下（受合并糖尿病、結締組織病、惡性腫瘤、使用糖皮質激素、免疫制劑等因素影響），細胞免疫功能低下亦是引起復發的重要因素。也有可能皮損局部存在免疫功能低下，導致皮損遷延不愈、反復復發，這也為多種方法治療尖銳濕疣提供了科學依據。目前，可用于治療尖銳濕疣方法眾多，包括物理治療（如液氮冷凍、CO2激光、手術等）、光動力治療、外用藥物治療（如5%咪喹莫特乳膏、0.5%鬼臼毒素酊、5% 5-氟尿嘧啶乳膏等）、抗病毒治療、提高免疫功能（如干擾素、轉移因子或胸腺肽等）等。對于尖銳濕疣治療方法的選擇需要對皮損數量、大小形態、位置、疣體角化程度、病程（初發或復發）以及合并疾病等因素進行綜合考慮。冷凍治療的優勢在于可以快速祛除肉眼可見的疣體，并且簡單易行，被臨床廣泛應用，其缺點是皮損復發率高，以及冷凍治療后局部出現水皰、糜爛、疼痛、色素沉著、色素脫失等。

近年來，光動力療法（ALA-PDT）被廣泛應用于皮膚腫瘤、皮膚癌前病變、痤瘡和尖銳濕疣等疾病的治療中，并取得良好的效果。ALA-PDT的作用機理是異常增生的組織吸收光敏劑后，經特定波長（紅光）和能量的光照射后［能量密度（100～150）J/cm2］，光敏劑受到激發發生光動力敏化反應，產生活性氧物質，進而選擇性地破壞病變組織。另外，ALAPDT可以直接作用于HPV，抑制病毒復制，進而清除HPV。還有研究表明，ALA-PDT可以改善患者全身和局部的免疫功能，提高機體抗HPV能力。此外，由于ALA-PDT可以誘導癌變或潛在的癌變細胞凋亡，ALA-PDT被證明是治療皮膚腫瘤、癌前病變有效的方法。本研究先采用冷凍治療祛除肉眼可見的疣體后，再聯合光動力療法，聯合治療組在治療結束后（第8周）肉眼可見疣體的復發率（12.50%）明顯低于單純冷凍治療組（45.00%）。而聯合治療組HPV清除率（48.57%）明顯高于單純冷凍治療組（18.18%）。由此可見，光動力療法可有效清除HPV或減少亞臨床感染和潛伏感染。光動力治療之所以能有效降低尖銳濕疣的復發率，是因為其包括抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡、對增生血管的直接損傷作用、誘發機體局部或（和）全身的免疫反應、抑制病毒復制等機制。王煥麗等利用光動力療法治療復發性尖銳濕疣患者的HPV轉陰率為42.5%，明顯高于對照組的17.5%，對HPV仍陽性的患者，HPV病毒載量下降程度也大于對照組。Owczarek W等的研究發現光動力療法對整體HPV的清除率可以達到66.67%，而對于低危型的HPV6/11，病毒清除率可以達到76.92%。有研究發現PDT治療6個月后HPV陰轉率為66.7%。一項薈萃分析顯示ALA-PDT治療后尖銳濕疣患者的疣體清除率可以達到96%，顯著高于激光（69%）或外用藥物（14%）治療的患者，復發率僅為7.5%，也顯著低于利用激光（24%）和外用藥物（31%）治療的患者。這些研究結果與本研究的結果相一致，都提示ALA-PDT可以提高疣體和HPV的清除率，減少復發。冷凍治療可以快速去除肉眼可見疣體；此外，冷凍還導致皮膚黏膜的損傷，也增加了ALA的吸收，兩種治療方法結合起來，揚長避短，優勢互補，療效顯著。既往的HPV亞臨床和潛伏感染的治療研究結果均顯示，有效的ALA-PDT（3次以上）可以有效清除HPV感染或減低病毒載量。但需要注意ALA-PDT治療局部刺激反應發生率較高，文獻報道其不良反應的發生率（69%）高于激光治療（28%）或外用藥物治療（30%）的患者。ALA-PDT治療后不良反應與ALA藥物的配置濃度和治療次數有著明顯的關系。因此ALA-PDT治療需要按照規范流程進行操作。文獻報道最佳治療次數為（3～5）次，ALA配置濃度以20%最為適宜，濃度太低治療效果差，濃度太高則局部不良反應增加。也有研究發現，高危型HPV感染尖銳濕疣患者如果要達到病毒學痊愈，ALA-PDT治療次數要高于低危型患者，因此，對于尖銳濕疣患者進行HPV亞型檢測對指導臨床治療具有重要的意義。

HPV和宿主之間的相互作用是一個漫長而又復雜的生物免疫過程，如僅使用傳統物理療法（如冷凍治療）去除疣體，HPV亞臨床感染和潛伏感染仍然存在，易導致尖銳濕疣復發，而且具有傳染性，可以通過性接觸或間接接觸傳染給性伴或家人。孕婦在分娩過程中，也可通過產道導致胎兒感染HPV。部分高危型HPV的持續感染與肛門生殖器癌的發生密切相關。因此，尖銳濕疣的治療目標應達到真正的生物學治愈，完全消除HPV對人體組織的有害影響。體外細胞學研究顯示，ALA-PDT治療后可以通過Ca2+-CamKKβ-AMPK通路導致Hela細胞（HPV18感染）的自噬，可能是其治療HPV感染的機制之一。并且，ALA-PDT治療后的HeLa細胞后，LC3II和p62呈現高表達，半胱天冬酶-3（caspase-3）和裂解半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）表達上調，提示通過ALA-PDT治療可能通過Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路來誘導細胞自噬和細胞凋亡，進而降低HPV病毒載量。

綜上所述，液氮冷凍聯合光動力療法可以顯著減少尖銳濕疣患者的HPV亞臨床感染和潛伏感染，提高HPV清除率。在選擇尖銳濕疣治療方法時，如果先選擇物理方法去除疣體（如冷凍治療），然后再進行光動力治療，可以更好地清除亞臨床感染和潛伏感染的HPV，進而減少尖銳濕疣的復發，但其確切機制仍需要進行更加深入的研究。