鐮刀菌根腐病拮抗菌的篩選及鑒定

樊炳君 姚麗 段嬌 羅昆艷 楊雪剛 焦鈺 朱國興 魏薇 曹艷茹

摘要：為了獲得具有抑制鐮刀菌根腐病的生防菌，從研究較少的蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中采集樣品分離菌株，運用平板對峙法從中進行4種鐮刀菌根腐病拮抗菌的初篩，共獲得10株有抑制效果的菌株。通過平板對峙法和發(fā)酵液涂布法進行復篩，獲得1株抑菌活性較強的拮抗菌株KC 121。根據生理生化特性和16S rDNA測序結果分析，將KC 121菌株鑒定為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。抑菌試驗結果顯示，KC 121對根腐病的4個病原菌（腐皮鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮孢菌）均有不同程度的抑制效果。同發(fā)酵液相比，菌體的抑菌效果較好。KC 121對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果達82.66%，對腐皮鐮刀菌的抑菌率達76.91%。KC 121的發(fā)酵液對擬枝孢鐮孢菌和腐皮鐮刀菌的抑菌率分別為84.76%和60.85%。本試驗結果可以為根腐病的生物防治提供菌種資源，具有進一步的研究和開發(fā)價值。

關鍵詞：鐮刀菌屬;根腐病;生防菌;鑒定;特基拉芽孢桿菌

中圖分類號： S432.4+4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）20-0132-06

收稿日期：2021-02-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31660002）;云南省教育廳科學研究基金（編號：2020Y0475）;云南省地方本科高校（部分）基礎研究聯合專項資金（編號：2018FH001-003）;云南省“萬人計劃”青年拔尖人才資助項目（編號：YNWR-QNBJ-2018-011）;省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題（編號：2019KF005）。

作者簡介：樊炳君（1996—），女，云南昆明人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護研究。E-mail：fanbingjun928@sina.com。

通信作者：曹艷茹，博士，副教授，主要從事微生物多樣性及功能挖掘研究。E-mail：yanrucao3@aliyun.com。

鐮刀菌（Fusarium）隸屬于菌物界真菌門，有性型是子囊菌門肉座菌的赤霉屬（Gibberella）、叢赤殼屬（Nectria）、麗赤殼屬（Calonectria）和小赤殼屬（Micronectriella），無性型是半知菌亞門瘤座孢菌科[1]。由于該屬菌株著生于子座上且具有月牙形或船形的分生孢子，1908年Link首次將其命名為鐮刀菌，并以粉紅鐮刀菌為模式種建立了鐮刀菌屬[2]。隨著科學技術的不斷進步，鐮刀菌屬的分類標準也逐步完善，目前被廣泛接受的種類約70余種[1]。作為重要的植物病原菌，鐮刀菌屬的菌株可危害眾多糧食作物、蔬菜、水果、中藥材和花卉等，造成嚴重的經濟損失[3-6]。鐮刀菌不僅會使作物萎蔫、腐爛和壞死，產生的毒素被人畜食用后也會引發(fā)中毒[7]。因此，針對該屬的防治研究一直受到人們的關注和重視。

鐮刀菌是一種土壤習居菌，以菌絲和孢子的方式越冬，常分布在植株的病殘體、帶病的種子和條件適宜的土壤中，具有寄主種類多、致病能力強和危害嚴重等特點[8]。目前對于鐮刀菌的防治措施主要是化學防治，應用于實際生產的生物防治研究還相對較少。劉利佳等通過篩選發(fā)現，62.5 g/L的精甲·咯菌腈懸浮種衣劑對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）的抑菌率達97.27%，是防治煙草鐮刀菌根腐病效果最佳的化學藥劑[9]。王國榮等研究發(fā)現甲基硫菌靈和戊唑醇及其復配制劑對芹菜莖基腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑制效果最好;在田間藥效試驗中發(fā)現，75%肟菌·戊唑水分散粒劑（WDG）和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（WP）的田間防效較好[10]。肖榮鳳等通過篩選發(fā)現2 000倍液的6.6%嘧菌酯·1.1%咯菌腈·3.3%精甲霜靈懸浮種衣劑和25%吡唑醚菌酯乳油對太子參根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌率均高于75%[11]。許樂等從丹參植株中分離獲得一株內生細菌多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）能夠有效抑制丹參根腐病病原菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）的生長[12]。牛世全等從鹽堿土壤中分離獲得一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對黃芪根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑制效果較好[13]。

運用生態(tài)環(huán)保的生物菌劑防治鐮刀菌屬菌株引起的病害，在綠色可持續(xù)防治病害的同時，還能保護人畜的健康。本研究從蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中分離原核微生物，從中篩選鐮刀菌根腐病的拮抗菌，為生物菌劑的研發(fā)提供更多菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 分離自筆者所在課題組于2019年9月采集的蘭坪鉛鋅尾礦樣品，采樣地的海拔范圍在 2 208～2 825 m，經緯度范圍為26°22′～26°24′N、99°23′～99°28′E，年平均氣溫為10.4～11.8 ℃，屬溫帶山地主體型季風氣候[14]。將重復菌株去除后，共從24個樣品中分離得到83個種的菌株，隸屬于4個門6個綱16個目22個科30個屬，具體信息見表1。

1.1.2 病原菌 腐皮鐮刀菌Fusarium solani（編號B6）、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum（編號B7）和尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum（編號B8）購買自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心;擬枝孢鐮刀菌Fusarium sporotrichioides（編號B9）購買自北京北納創(chuàng)聯生物技術研究院。

1.2 菌株培養(yǎng)

1.2.1 供試菌株培養(yǎng) 從保藏試管中挑取供試菌株接種在ISP 2培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 3～7 d[15]。

1.2.2 病原菌培養(yǎng) 從保藏試管中挑取病原菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于 25 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)7 d[16]。

1.3 拮抗菌的初篩

運用平板對峙法[17]將供試菌株接種于ISP 2平板上（10株/皿），于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d后，在平板中央接種直徑為8 mm的病原菌菌塊，在 25 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果，對有抑菌活性的陽性菌株進行復篩。

1.4 拮抗菌的復篩

1.4.1 供試菌體對病原菌生長的影響 運用平板對峙法把篩選出的陽性菌株按4點法接種于PDA平板上，方法同“1.3”節(jié)，每個處理重復3組，以不接供試菌株為空白對照。

1.4.2 供試菌株發(fā)酵液對病原菌生長的影響 把篩選出的陽性菌株接種于ISP 2液體培養(yǎng)基，置于200 r/min 28 ℃的搖床培養(yǎng)5 d后，離心收集上清液，得到菌株的發(fā)酵液，再將其用0.22 μm的細菌過濾器進行過濾。將200 μL過濾發(fā)酵液涂布于PDA平板，待培養(yǎng)基表面將液體吸收后將直徑為 8 mm 的病原菌菌塊接種于其上[18]，在25 ℃恒溫箱培養(yǎng) 7 d 后觀察抑制效果并計算抑菌率[19]，每個處理重復3組，以清水涂板為空白對照。所獲數據通過SPSS Statistics軟件進行差異顯著性分析。

抑菌率=對照組菌落直徑-處理組菌落直徑對照組菌落直徑-0.8 cm×100%。

1.5 拮抗菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察 在ISP 2培養(yǎng)基上將“1.4”節(jié)中篩選出的陽性菌株進行劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況及形態(tài)特征。

1.5.2 生理生化特性檢驗[20] 測定菌株產生接觸酶、脲酶和酯酶的能力，檢測菌株水解淀粉、明膠液化、牛奶胨化、分解纖維素、還原硝酸鹽和產生硫化氫的能力，同時進行甲基紅（MR）試驗和V-P試驗。

1.5.3 分子鑒定 采用酶法小量DNA提取法提取菌體的基因組DNA[15]，運用16S rRNA基因的通用引物（PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[21]進行PCR特異擴增，隨后送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將獲得的16S rRNA基因序列提交到EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/identify）進行比對，用MEGA 7軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發(fā)育樹，確定菌株種屬。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的初篩

從前期分離獲得的83株菌株中，篩選得到10株具有不同程度抑制根腐病病原菌的菌株（表2）。其中，拮抗腐皮鐮孢菌的生防菌最少，僅有1株;而拮抗擬枝孢鐮孢菌和禾谷鐮刀菌的生防菌相對較多，分別有7株和5株。KC 94和KC 112對2種病原菌的生長有拮抗作用，其余的7株供試菌株僅對1種病原菌有抑制效果。僅有KC 121對4種病原菌都具有拮抗活性，因此選擇KC 121進行后續(xù)的復篩工作。

2.2 拮抗菌的復篩

2.2.1 拮抗菌KC 121對病原菌生長的影響

如圖1所示，KC 121對根腐病的4種病原菌都有不同程度的抑制作用。其中，除對尖孢鐮刀菌的抑制率較低外，對腐皮鐮孢菌、禾谷鐮刀菌和擬枝孢鐮孢菌的抑菌率均高于50%，抑制效果最為明顯的是擬枝孢鐮孢菌，高達82.66%（表3）。

2.2.2 拮抗菌KC 121發(fā)酵液對病原菌生長的影響

病原菌在涂有發(fā)酵液的平板上培養(yǎng)7 d后觀察發(fā)現（表4），KC 121發(fā)酵液對腐皮鐮孢菌和擬枝孢鐮孢菌的抑制作用較好，抑菌率分別為60.85%和8476%;而對禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的抑制作用則相對較差，均不到50%，抑菌率最低的為9.20%。

2.3 拮抗菌KC 121的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 KC 121在ISP 2培養(yǎng)基中 28 ℃、培養(yǎng)16 h后觀察發(fā)現，菌落呈淺肉色，邊緣不規(guī)則且顏色淺于中央，表面褶皺、干燥（圖2）。

2.3.2 生理生化特性 如表5所示，KC 121是一株具有接觸酶和脲酶活性的菌株，能夠消化的脂肪酸鏈長度為60，具有液化明膠、胨化牛奶、水解淀粉和還原硝酸鹽的功能，不具備分解纖維素和產生硫化氫的能力。

2.3.3 分子生物學鑒定 菌株KC 121經16S rRNA基因測序后得到大小為1371bp的序列片段，將其提交到GenBank獲得16S rDNA序列登錄號為MW652665，同時在EzBioCloud （https：//www.ezbiocloud.net/identify）進行比對， 用 MEGA 7軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發(fā)育樹[22]。KC 121的16S rRNA基因序列與Bacillus tequilensis（KF036187和MG004174）在系統發(fā)育樹上同屬一個分支，證明KC 121與特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）的親緣關系最近（圖3）。

3 結論與討論

利用筆者所在課題組前期從蘭坪鉛鋅尾礦樣品中分離得到的83株菌進行根腐病病原菌的生防菌篩選研究，初篩獲得10株對不同病原菌具有不同抑制效果的生防菌，從中選擇了1株能同時抑制腐皮鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌4種病原菌的菌株KC 121進行后續(xù)的復篩試驗。本試驗借鑒醫(yī)學和藥理學等研究中的平板涂布法[18，23]，首次將菌株的發(fā)酵液涂布于平板上進行農業(yè)病害拮抗菌的篩選。通過平板對峙法和發(fā)酵液涂布法2種方法進行復篩，發(fā)現KC 121和其發(fā)酵液對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果均較好，抑菌率均達80%以上;但對尖孢鐮刀菌的抑制效果相對較差，抑菌率均低于50%。在針對禾谷鐮刀菌時，KC 121的菌體本身對病原菌菌絲生長的抑菌率為65.31%，但發(fā)酵液對其的抑菌率僅有9.20%，出現該情況的原因可能是由于抑菌物質為胞內產物，或是發(fā)酵條件（溫度、培養(yǎng)基、時間和pH值等）不適宜所導致的。

結合形態(tài)學、生理生化試驗檢測及分子生物學測定，鑒定KC 121菌株為特基拉芽孢桿菌。多項研究報道表明，特基拉芽孢桿菌在諸多方面都有十分重要的作用與應用價值。在農業(yè)上，Cuellar等發(fā)現特基拉芽孢桿菌產生的脂肽能夠顯著降低香蕉葉斑病發(fā)生的嚴重性[24];周瑚等研究發(fā)現特基拉芽孢桿菌對多種植物病原菌有抑制作用，例如稻瘟病菌、辣椒膠孢炭疽菌、煙草赤星病菌、黃瓜疫病菌和卵菌具有一定的抑制作用[22]。在工業(yè)上，Angural等將特基拉芽孢桿菌應用在紙漿漂白中[25];Singh等研究發(fā)現特基拉芽孢桿菌能夠產生生物表面活性劑，該活性劑可作為一種消毒劑或類似消毒劑的成分，對浮游細菌和生物膜中滯留的細菌均有殺菌作用[26]。在食品加工過程中，具有果膠酶活性的特基拉芽孢桿菌具備去除咖啡種子漿層的能力，部分純化的果膠酶具有澄清果汁的作用[27]。而本研究首次發(fā)現了特基拉芽孢桿菌能夠同時對鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌4種病原菌生長起拮抗作用，其中對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果最好，抑菌率達80%以上，為后期運用生物手段防治該病害提供了菌種資源。

菌株KC 121來源于重金屬含量較高的尾礦極端環(huán)境。目前已有大量研究證明極端環(huán)境中存在豐富的防治農業(yè)病蟲害的微生物資源。王彥等在河西走廊敦煌地區(qū)的鹽堿土壤中分離篩選出1株鏈霉菌屬菌株對黃瓜枯萎病病菌有良好的拮抗效果[28];閆建芳等在連黃海海域海底沉積物樣品中獲得1株密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）對番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensis）有較好的抑制作用[29];鄭梅霞等從高海拔的可可西里和西藏樣品中篩選得到2株能抑制番茄根腐病病原菌的枯草芽孢桿菌[30];羅曼等在南極沉積物樣品中獲得1株具有廣譜抑菌作用的枯草芽孢桿菌斯氏亞種（Bacillus subtilis subsp. spizizenii），對絲瓜和辣椒的枯萎病病菌均有較強的抑制效果，對長豆褐腐病也有較明顯的拮抗作用[31]。針對尾礦地區(qū)微生物的研究主要集中在多樣性分析及重金屬的污染生態(tài)修復等方面[32-36]，尚未發(fā)現農業(yè)生防菌的相關研究和報道。本研究首次從含有大量重金屬的蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中篩選生防菌，獲得了活性較好的菌株，但抑菌物質、抑菌機理等方面還尚未明確，后續(xù)還需要進行更為深入的試驗及研究。

參考文獻：

[1]賀運春. 真菌學[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2008.

[2]張素軒. 鐮刀菌屬分類進展[J]. 真菌學報，1991，10（2）：85-94.

[3]周 默，白慶榮. 內蒙古莫旗黃芪根腐病病原的分離與鑒定[J]. 東北農業(yè)科學，2021，46（2）：52-55，61.

[4]張俊慶，鄭安科，高立紅，等. 辣椒枯萎病主要致病菌的分離鑒定及農用拮抗菌篩選[J]. 安徽農業(yè)科學，2021，49（8）：134-137.

[5]趙東曉，陳 悅，夏 博，等. 沙棘枝干枯萎病癥狀觀測與病原菌室內化學藥劑篩選[J]. 中國水土保持，2021（4）：50-53.

[6]王彤彤，鄔昊月，趙尊練，等. 陜西省大蔥葉部鐮刀菌枯萎病病原菌的鑒定[J/OL]. 植物病理學報（2021-04-01）[2021-04-20].https：//doi.org/10.13926/j.cnki.oppd.000568.

[7]De Oliveira R L，Reis G M，Da Silva V N，et al. Molecular characterization and fumonisin production by Fusarium verticillioides isolated from corn grains of different geographic origins in Brazil[J]. International Journal of Food Microbiology，2011，145（1）：9-21.

[8]林鎮(zhèn)躍，闕友雄，劉平武，等. 植物致病鐮刀菌的研究進展[J]. 中國糖料，2014（1）：58-64，78.

[9]劉利佳，李芳芳，何 雷，等. 煙草鐮刀菌根腐病病原菌的鑒定及其對5種殺菌劑的敏感性分析[J]. 河南農業(yè)科學，2021，50（7）：101-109.

[10]王國榮，馮曉曉，吳慧明，等. 芹菜莖基腐病病原菌鑒定、消長動態(tài)調查與防治藥劑篩選[J]. 浙江農業(yè)學報，2021，33（4）：661-669.

[11]肖榮鳳，陳燕萍，陳梅春，等. 太子參根腐病病原菌的鑒定及防治藥劑篩選[J]. 植物保護學報，2020，47（6）：1333-1342.

[12]許 樂，王子強，張 爽，等. 丹參根腐病拮抗細菌篩選、鑒定及生防機理研究[J]. 中國生物防治學報，2021，37（4）：846-854.

[13]牛世全，李 靜，張雪瑩，等. 一株抗黃芪根腐病芽孢桿菌的篩選、鑒定及抑菌物質的初步研究[J]. 西北師范大學學報（自然科學版），2021，57（2）：79-86.

[14]程先鋒，宋婷婷，陳 玉，等. 滇西蘭坪鉛鋅礦區(qū)土壤重金屬含量的高光譜反演分析[J]. 巖石礦物學雜志，2017，36（1）：60-69.

[15]樊炳君，曹艷茹，紀開娟，等. 桉樹根際放線菌的分離、初步鑒定及酶活篩選[J]. 昆明學院學報，2020，42（3）：64-70.

[16]樊炳君，趙玉美，陳俊珠，等. 云南核桃葉枯病病原鑒定及其生物學特性[J]. 植物保護，2020，46（3）：123-130.

[17]馬 騰，張知曉，戶連榮，等. 一株核桃真菌病害生防菌的鑒定及抑菌特性研究[J]. 中國森林病蟲，2020，39（6）：10-15.

[18]宋劍武，王鵬霞，吳永繼，等. 迷迭香酸與抗菌藥聯合對含fosA3基因細菌抑菌效果的研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（7）：1851-1858.

[19]許麗婷，陳佳欣，李歡歡，等. 生防菌XC-1的篩選、鑒定及其對馬鈴薯黑痣病的防效研究[J]. 植物病理學報，2021，51（3）：413-422.

[20]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：353-398.

[21]Marchesi J R，Sato T，Weightman A J，et al. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（2）：795-799.

[22]周 瑚，鄒秋霞，胡 玲，等. 特基拉芽孢桿菌JN-369的分離鑒定及其抑菌物質分析[J]. 農藥學學報，2019，21（1）：52-58.

[23]劉 波，李雪駝，徐和利，等. 5種中藥制劑殺滅幽門螺桿菌的實驗研究[J]. 中國新藥雜志，2002，11（6）：457-459.

[24]Cuellar G T Z，González J L M，Villegas E V. Role of Bacillus tequilensis EA-CB0015 cells and lipopeptides in the biological control of black Sigatoka disease[J]. Biological Control，2021，155（4）：104523.

[25]Angural S，Kumar A，Kumar D，et al. Lignolytic and hemicellulolytic enzyme cocktail production from Bacillus tequilensis LXM 55 and its application in pulp biobleaching[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2020，43（12）：2219-2229.

[26]Singh A K，Sharma P. Disinfectant-like activity of lipopeptide biosurfactant produced by Bacillus tequilensis strain SDS21[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2020，185：110514.

[27]Koshy M，De S. Effect of Bacillus tequilensis SALBT crude extract with pectinase activity on demucilation of coffee beans and juice clarification[J]. Journal of Basic Microbiology，2019，59（12）：1185-1194.

[28]王 彥，牛世全，鄭豆豆，等. 黃瓜枯萎病拮抗放線菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 微生物學通報，2019，46（5）：1062-1073.

[29]閆建芳，劉 秋，趙柏霞，等. 番茄潰瘍病生防菌YH23的發(fā)酵條件優(yōu)化及菌種鑒定[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，2019，50（5）：608-613.

[30]鄭梅霞，朱育菁，劉 波，等. 高海拔來源芽胞桿菌根腐生防菌的篩選與鑒定[J]. 福建農業(yè)學報，2017，32（9）：996-1000.

[31]羅 曼，萬婧倞，黃仕新，等. 南極沉積物來源抗菌細菌的篩選及抑菌物質的鑒定[J]. 微生物學通報，2020，47（6）：1787-1794.

[32]Njoku K L，Akinyede O R，Obidi O F. Microbial remediation of heavy metals contaminated media by Bacillus megaterium and Rhizopus stolonifer[J]. Scientific African，2020，10：1-17.

[33]楊雍康，藥 棟，李 博，等. 微生物群落在修復重金屬污染土壤過程中的作用[J]. 江蘇農業(yè)學報，2020，36（5）：1322-1331.

[34]彭玙萍，曾偉民. 紫金山銅礦酸性礦山廢水微生物群落多樣性[J]. 微生物學通報，2020，47（9）：2887-2896.

[35]李司宇，劉 雪，王文婧，等. 微生物在重金屬離子污染修復及治理中的應用研究[J]. 環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展，2020，45（2）：158-160.

[36]房保柱，王怡歡，張 堃，等. 凡口鉛鋅礦酸性底泥可培養(yǎng)微生物資源的探索分離[J]. 微生物學雜志，2020，40（2）：10-21.