玉米抗感粗縮病重要miRNA及其靶基因的詮釋

吳斌 崔漢青 張眉 邵春國 姜珊珊 郭霞 徐德坤 王升吉

摘要：借助高通量測序和生物學分析手段，篩選不同抗性品種間的差異表達miRNA，預測相關靶基因。對玉米抗、感粗縮病不同種質材料高通量測序鑒定出的差異miRNA的靶基因，在Genome、Gene Ontology等生物信息數據庫中進行比對，同時做GO（Gene Ontology，簡稱GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，簡稱KEGG）富集性分析。從某些相關差異miRNA的靶基因及其作用位點的有關GO ID及其生物學功能注釋中，發現一些可能與玉米粗縮病抗性有較大關系的miRNA，如zma-miR156a、zma-miR156k、zma-miR1432等;通過進一步的miRNA靶基因KEGG富集性分析，獲得代謝通路ID，根據其生物功能注釋，推測也有一定數量的miRNA與玉米種質抗（感）病相關。結合所涉差異miRNA在玉米抗、感種質接毒前后上、下調的表現，對這些重要miRNA靶基因可能涉及粗縮病的致病機制或玉米抗性相關的GO ID、KEGG通路ID所蘊含的功能進行了詮釋。研究旨在探明抗病相關miRNA通過靶向作用其靶基因，在抗病過程中可能發揮的重要生物學功能和作用途徑，研究結果可為探討玉米抗粗縮病的抗病機制研究奠定理論基礎。

關鍵詞：玉米粗縮病;差異miRNA;高通量測序;靶基因;富集分析

中圖分類號：S435.13? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）20-0064-06

收稿日期：2021-02-11

基金項目：山東省重點研發計劃（編號：2018GSF121029）;國家重點研發計劃（編號：2018YFD0200603）;山東省農業科學院農業科學創新工程（編號：CXGC2016B11-綠色防控）。

作者簡介：吳 斌（1986—），男，山東臨清人，博士，助理研究員，主要從事植物病毒學研究。E-mail：wubin228@126.com。

通信作者：王升吉，碩士，研究員，主要從事植物病毒學研究。E-mail：shjiw@163.com。

玉米粗縮病（maize rough dwarf virus，簡稱MRDV）是玉米生產中一類重要的病害，嚴重影響了玉米生產[1]。該病由帶毒灰飛虱傳播病毒，在山東省，其主要毒原為水稻黑條矮縮病病毒（rice black-streaked dwarf virus，簡稱RBSDV）[2-3]。前期研究發現，種植抗病品種是防治該病的重要措施，因此，發掘玉米粗縮病抗性相關基因、微小核糖核酸（miRNA）或反式作用干擾小RNA（ta-siRNA）等，分析其功能進而探究其抗病機制，可為抗病品種的遺傳改良提供理論依據和技術支持。

miRNA是真核生物體內的一類負調控因子，在植物生長發育調節和病害防御中具有重要作用[4]。病毒在侵染寄主植物的過程中能夠誘導大量miRNA產生，這些miRNA在病毒侵染時上調或下調表達，通過抑制防衛反應中的負調控因子和促進防衛反應中的正調控因子來行使功能。Wu等發現，水稻條紋病毒侵染水稻后，miR168與AGO18互作，調控水稻體內AGO1的表達，進而表現出抗病[5]。

本研究對RBSDV侵染不同抗性玉米品種所獲葉片、莖稈組織進行miRNA高通量測序，對鑒定出的重要差異表達miRNA的靶基因開展GO、KEGG富集性分析，對其在玉米抗粗縮病中的生物學功能進行闡述和討論，以期探究其在抗病過程中發揮的重要生物學功能和作用途徑，進而為研究玉米抗粗縮病的抗病機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要材料如下：玉米抗、感粗縮病品種分別為農大108、鄭單958;感染水稻黑條矮縮病病毒（RBSDV）的水稻（或小麥）病株;人工養殖2～3齡的灰飛虱無毒若蟲;小麥易感病品種;健康水稻幼苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 測序用玉米病株、健康株的獲得 該工作是通過人工接RBSDV方法完成的，主要包括以下幾個步驟：人工養殖繼代灰飛虱;2個玉米品種的盆栽播種;2、3齡灰飛虱若蟲從RBSDV病株上飼毒，并將度過循回期的帶毒灰飛虱接于1～2葉期的玉米幼苗上傳毒;將獲毒后的玉米幼苗移栽于大田中并生長至喇叭口期，具體參見任春梅等的方法[6-7]。同期播種的玉米苗，保留足夠數量不接毒的幼苗，肥、水等生長栽培管理同人工接毒苗。

1.2.2 miRNA高通量測序 待鄭單958玉米接毒株充分發病后，依照測序樣品分類信息（表1）進行樣品采集，用液氮速凍、干冰保存等方式送至杭州聯川生物技術股份有限公司進行miRNA的文庫構建和高通量測序。

1.2.3 miRNA測序原始數據統計分析 測序獲得原始序列（raw reads）后，首先去除3′端接頭序列和垃圾序列，例如序列中有80%A/C/G/T、3N（不一定是連續的）序列，獲得凈化的序列（clean reads）;然后進行長度篩選，對于植物，保留堿基為18～25 nt 的序列;接著將剩余的序列與mRNA、RFam（含rRNA、tRNA、snRNA等）和Repbase數據庫進行比對，并進行過濾，獲得有效序列（valid reads），去除重復序列，獲得單一原始序列和單一有效序列;對miRNA的長度分布情況進行統計。

1.2.4 miRNA差異表達分析 統計測序結果中各樣品miRNA的表達量，并進行2個品種相同組織在接種病毒、未接種病毒處理間的比對，篩選差異表達miRNA的標準為差異倍數|log2 （fold change）|>2、P<0.05。

1.2.5 差異表達miRNA靶基因的預測及富集分析 借助Target Finder對差異表達miRNA的靶基因進行預測，通過靶基因注釋對玉米miRNA靶基因在生物學功能上行使的生物學作用進行分析。候選靶基因的注釋借助于Gene Ontology（簡稱GO，http：//www.geneontology.org/）和Genome中的KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）數據庫。

2 結果與分析

2.1 miRNA測序有效數據產出統計

待8個玉米miRNA文庫通過高通量測序后，對每個文庫內的全部小RNA片段進行測序，獲得相應的原始序列數。然后進行長度篩選，過濾掉堿基長度小于18 nt、大于25 nt的序列，去除重復的miRNA序列，分別獲得有效序列、單一有效序列等，詳見表2。

2.2 miRNA的長度分布

在對測序的原始數據進行分析統計的基礎上，對8個樣品文庫中過濾去重后的有效（valid）序列總數（total）以及種數（unique）進行長度分布統計，發現其豐度主要集中于18～25 nt，且在24 nt處的序列豐度最大（圖1）。

2.3 差異miRNA的上下調統計分析

通過對抗、感粗縮病2個品種的相同組織在接種病毒、未接種病毒處理間進行比對，并用TPM算法進行歸一化處理，獲得幾個樣品比較組有上調、下調差異性表達的miRNA情況。從圖2可以看出，抗病品種農大108接毒后，健康植株莖稈、葉片材料較接毒前健康植株的比較組（ChL1 vs nChL1，ChL1 vs nChL1）的差異miRNA下調數明顯較上調數多，而感病品種鄭單958接毒后病株miRNA較接毒前健康植株（CdL9 vs nChL9，CdS9 vs nChS9）的比較組則相反，其差異miRNA的上調數較下調數多，尤其在葉片材料中，這可能是玉米抗病品種抗病機制的一種表現。

2.4 差異表達miRNA的篩選

通過對8個文庫中的miRNA進行歸一化分析，確認相關miRNA的表達差異。由表3可以看出，zma-miR156a-5p、zma-miR1432-5p、zma-miR390a-5p、zma-miR156k-5p、zma-miR396f-3p、zma-miR166a-3p、zma-miR164f-5p、zma-miR167e-5p、zma-miR394a-5p等9個miRNA在感病品種鄭單958和耐病品種農大108的葉片、莖稈組織中接毒前后表達趨勢相反，因此選擇這9個miRNA作為重要miRNA展開研究。

2.5 差異表達miRNA靶基因的GO分析

對篩選出的9個差異miRNA的靶基因與Genome、Gene Ontology等生物信息數據庫中的數據進行比對，進行GO富集性分析，發現差異miRNA的部分靶基因及其作用位點的生物學功能與玉米粗縮病抗性密切相關。其中，zma-miR156a-5p的部分靶基因與寄主對病原物的防御性反應相關，zma-miR1432-5p的部分靶基因與病毒的加工、裝配有關，zma-miR390a-5p的部分靶基因與病毒粒子在寄主內細胞間的傳輸有關，其他miRNA的靶基因也多參與寄主的細胞信號傳導、免疫應答的防衛性反應等（表4）。

2.6 差異表達miRNA靶基因KEGG分析

對篩選出的差異表達miRNA靶基因進行KEGG富集性分析發現，部分通路可能與玉米種質抗病（粗縮病）性相關。其中多個miRNA涉及的ko04626-植物病毒與植物寄主與病原間的相互作用、ko00130-泛醌及其他萜類醌的生物合成、ko04075-植物激素信號傳導、ko00280-泛素介導的蛋白水解作用相關（表5）。對ko04626通路分析發現，靶基因通過調控RAR1、SGT1、HSP90等關鍵基因參與玉米與病原物的互作（圖3）。

3 結論與討論

當前對于玉米粗縮病的研究多聚焦于致病機制方面，對于其抗病機制的研究相對較少。水稻黑條矮縮病病毒通過細胞外壁的傷口或昆蟲介體刺吸而造成微傷侵染玉米后，會引起寄主防御系統中相關基因表達、蛋白質合成、激素水平及生物途徑的變化，使玉米生長受阻、發育不良，最終導致發病甚至死亡[8-10]。在此期間，玉米抗、耐病品種被植物病毒侵染誘導寄主產生大量的miRNA中，相關miRNA即可通過上調或者下調等模式，抑制防衛反應中的負調控因子或促進防衛反應中的正向調控因子，進而行使功能，可能是玉米抗耐病機制的一種表現[11]。本研究中涉及的zma-miR156、zma-miR1432、zma-miR390a-5p、zma-miR164f-5p等多個miRNA，均在受到RBSDV侵染脅迫后，在玉米抗、感病種質材料中呈現相反的表達趨勢，且存在2種情況，部分在抗性材料（農大108）中表現為上調，在感病材料（鄭單958）中表現為下調，另一種情況恰好相反，分析其原因，可能是miRNA的靶基因在抗病防御性反應中的正、負調控機制差異所致。

此外，在本研究中，抗耐病品種農大108接毒后，與接毒前相比，健康植株莖稈、葉片中差異miRNA下調數明顯較上調數多，與感病品種鄭單958在接毒后病株與接毒前健康植株比較的情況相反，可能是玉米抗、感品種分別受到粗縮病侵染脅迫時內源miRNA自身反饋調節的一種真實體現。農大108受到粗縮病病原侵染后，差異miRNA下調數多于上調數，可能由于miRNA所起作用的靶基因負調控作用機制相對較多，從而抑制了抗耐病品種植株發病，而感病品種鄭單958受到病毒侵染后，差異miRNA的上調數多于下調數，植物病毒在與寄主的互作中占據優勢，導致寄主發病。

另有研究者分別對水稻與玉米miRNA及其靶基因對玉米粗縮病病毒的應答通路進行了研究[12-14]，結果顯示，一些miRNA家族及其靶基因在玉米與病毒互作中起著重要作用[14]。例如，與泛素有關（miR166a-3p等）的靶基因的表達受抑制，泛素合成途徑相關基因的表達發生變化，表明泛素途徑在玉米抗粗縮病中起著重要作用。黃強的研究結果表明，RBSDV的侵染引起玉米中吲哚-3-乙酸（IAA）含量下降，玉米素核苷（ZR）相對保持不變，細胞分裂素與生長素的比值（C/A）升高，引起玉米頂端優勢喪失，并導致細胞分化的紊亂，出現植株矮縮、脈突、心葉無法抽出等生長畸形癥狀，粗縮病癥狀迅速表現，導致植株畸形生長[9]。

此外，1種miRNA（例如miR156）可同時參與玉米的生長發育、信號傳導、轉錄調控等多種功能，并在粗縮病脅迫響應過程發揮重要作用[15-16]。分析其原因可能是玉米粗縮病誘導玉米體內miRNA調控其靶基因參與信號傳導、抗氧化脅迫、自身反饋調節、抗病相關代謝等途徑[17-18]，各類抗病途徑共同構建了玉米抗粗縮病脅迫的復雜的防御機制。

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