重組魚(yú)精蛋白的制備及抑菌活性分析

李招發(fā) 邱丹丹

（1. 華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院，泉州 362021；2. 華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，泉州 362021）

魚(yú)精蛋白（protamine，Pro）是一種由30-50個(gè)氨基酸組成的多聚陽(yáng)離子肽，以精氨酸為主，存在各類(lèi)雄魚(yú)成熟精巢組織與帶負(fù)電的DNA緊密結(jié)合［1］。Pro抑菌作用具有廣譜性、高效性和安全性。Pro對(duì)黃色葡萄球菌、酵母菌、霉菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及四鏈球菌均表現(xiàn)為抑制效果，可作為綠色防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)中［2-4］。現(xiàn)在普遍認(rèn)為魚(yú)精蛋白抑菌活性是由其分子中存在著大量精氨酸，精氨酸中的正電荷胍基與細(xì)胞壁肽聚糖的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電作用，但它們均能與細(xì)胞膜特異性結(jié)合，通過(guò)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞不能正常運(yùn)行［5］。在手術(shù)中，Pro作為肝素抗凝血?jiǎng)┯糜谝蚋嗡刈⑸溥^(guò)量而引起的出血；還可以延遲或阻止胰島素的釋放［6-7］。Pro與 DNA 有較強(qiáng)的結(jié)合能力，作為DNA藥物載體而被廣泛應(yīng)用［8-9］。

細(xì)胞珠蛋白（cytoglobin，CYGB）是 Kawada等［10］在大鼠肝星狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種六配位血紅素球蛋白，分子量為21.4 kD。研究表明CYGB具有過(guò)氧化物酶活性和清除氧自由基的功能，并能通過(guò)調(diào)控CYGB基因的表達(dá)抑制肝纖維化［11］。本課題研究表明，CYGB在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量極大，可借助CYGB蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高效表達(dá)［12］。魚(yú)精蛋白的主要來(lái)源是天然提取，產(chǎn)量受限，且魚(yú)精蛋白富含精氨酸，這樣編碼的氨基酸序列在大腸桿菌中是難以表達(dá)的［13］，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用。本研究旨在通過(guò)基因工程技術(shù)，通過(guò)CYGB融合表達(dá)，探索大量制備重組魚(yú)精蛋白的可行性。因后續(xù)純化過(guò)程中需用CNBr切割CYGB-Pro中的甲硫氨酸位點(diǎn)，以裂解出重組 Pro（recombinant protamine，rPro）。將CYGB內(nèi)部的甲硫氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子ATG全部突變?yōu)楫惲涟彼釋?duì)應(yīng)的密碼子ATC（起始密碼子除外）獲得CYGBm。采用CYGB與Pro融合，并在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。為重組抗菌肽的研究和開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）、pET22b、pET22b-CYGB均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。pUC57-Pro為上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 試劑與材料 硫酸魚(yú)精蛋白（Sigma公司）；NdeⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、BamHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、BglⅡ限制性?xún)?nèi)切酶、EcoRⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、Pyrobest DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒（碧云天生物公司）；引物合成（表1）、DNA 測(cè)序（上海生工生物工程有限公司完成）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 本研究涉及的寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotide sequences involved in this study

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pET22b-CYGBm 的構(gòu)建與表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以實(shí)驗(yàn)室保存的pET22b-CYGB質(zhì)粒為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.6為下游引物，PCR得片段1-6，以SEQ ID NO.7為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段7-8，核酸電泳后，回收片段1-6和7-8。以回收片段1-6和7-8為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游，PCR得片段（1-8）67，核酸電泳后，回收片段（1-8）67。以回收片段（1-8）67模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.4為下游引物，PCR得片段1-4，以SEQ ID NO.5為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段5-8，核酸電泳后，回收片段1-4和5-8。以回收得到的片段1-4和5-8為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段（1-8）45，核酸電泳后，回收片段（1-8）45。以回收片段（1-8）45模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.2為下游引物，PCR得片段1-2，以SEQ ID NO.3為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段3-8，核酸電泳后，回收片段1-2和3-8。以回收片段1-2和3-8為模板，以SEQ ID NO.1為上游引物，以SEQ ID NO.8為下游引物，PCR得片段（1-8）23，即CYGBm。CYGBm和pET22b用NdeI/EcoRI雙酶切，核酸電泳后，回收目的片段，T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建pET22b-CYGBm（圖1）。將質(zhì)粒pET22b-CYGBm與BL21感受態(tài)混合，42℃熱激轉(zhuǎn)化，37℃ 100 μL/mL（Amp+）LB 平板（10 g/L tryptone，5 g/L yeast extarct，10 g/L NaCl） 培 養(yǎng)20 h，挑選單克隆菌落（上海生工生物工程有限公司DNA 測(cè)序結(jié)果正確），接入乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基（15 g/L tryptone，12 g/L yeast extarct，3 g/L NaH2PO4·2H2O，7 g/L K2HPO4·3H2O，2.5 g/L NaCl，0.2%葡萄糖，2.1 mmol/L乳糖，0.05% MgSO4·7H2O）中，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h，收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)CYGBm在原核表達(dá)系統(tǒng)情況。

圖1 重疊延伸PCR定點(diǎn)突變CYGB流程圖Fig. 1 Flow chart of fixed point mutations CYGB by overlapping extended PCR

1.2.2 工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro的構(gòu)建與表達(dá)實(shí)驗(yàn) pUC57-Pro質(zhì)粒（上海生工生物工程有限公司合成）和pET22b-CYGBm質(zhì)粒經(jīng)NdeI/EcoRI雙酶切，核酸電泳后，回收目的片段，通過(guò)T4 DNA Ligase將pET22-CYGBm與Pro連接，構(gòu)建pET22-CYGBm-Pro。將pET22b-CYGBm-Pro與BL21感受態(tài)混合，42℃熱激轉(zhuǎn)化，37℃ 100 μL/mL（Amp+）LB平板培養(yǎng)20 h，挑選單克隆菌落經(jīng)PCR法和雙酶切法驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆子命名為工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro。工程菌BL21-pET22b-CYGBm-Pro接入乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h，乳糖誘導(dǎo)菌液于4℃，10 000 r/min離心20 min，收集菌體存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 rPro 的純化實(shí)驗(yàn) 將上述收集的菌體稱(chēng)重，經(jīng)-80℃和4℃反復(fù)凍融3、4次，以1∶10的比例加入包涵體破菌液（1.22 g Tris-HCl、5.85 g NaCl、0.075 g EDTA、3.3 mL 30%曲拉通 X100，加入 150 mL 超純水溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 200 mL），冰中懸浮菌體，冰浴超聲，功率200 W，5 s超聲，5 s間歇，4℃，10 000 r/min離心20 min，棄上清，收集包涵體沉淀。按3倍體積量加入包涵體洗滌液（3.1 g Tris-HCl、14.63 g NaCl、0.186 g EDTA、8.3 mL 30%曲拉通 X100、60.2 g 尿素，加入 400 mL 超純水溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 500 mL），重懸沉淀，冰中搖動(dòng)洗滌10 min，4℃，10 000 r/min，離心20 min。如此重復(fù)3、4次。加入適當(dāng)包涵體溶解液（3.1 g Tris-HCl、14.63 g NaCl、0.186 g EDTA、242.5 g 尿素，加入 400 mL 超純水溶解，調(diào) pH 至 8.0，定容至 500 mL），重懸沉淀，冰浴平緩搖動(dòng)1 h后4℃冰箱放置過(guò)夜以充分溶解，10 000 r/min，離心20 min，收集上清。上清液經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠過(guò)濾，CYGBm-Pro復(fù)性，并初步除去小分子雜質(zhì)。Sephadex G-25凝膠過(guò)濾接收液再經(jīng)肝素瓊脂糖凝膠層析柱純化、CM陽(yáng)離子瓊脂糖凝膠層析柱分離純化，獲得重組CYGBm-Pro融合蛋白。純化后的重組融合蛋白CYGBm-Pro經(jīng)0.2 mmol/L濃鹽酸和50 mg/mL CNBr避光室溫裂解24 h，經(jīng)20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠過(guò)濾，即得純化的rPro。

1.2.4 rPro的抑菌活性分析實(shí)驗(yàn) 利用試管培養(yǎng)法分析rPro對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及巴斯德畢赤酵母GS115 的抑菌活性。取活化菌液10 μL接種于5 mL 培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h 后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，分析測(cè)試菌加rPro（168.96 μg/mL、84.48 μg/mL、42.24 μg/mL、21.12 μg/mL）和陰性對(duì)照（去離子水）的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算抑制率（inhibition rate）＝（陰性對(duì)照OD600-加rPro OD600）/陰性對(duì)照OD600，從而檢測(cè)分析抑菌活性。

1.2.5 rPro在魚(yú)蝦儲(chǔ)存中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取經(jīng)21.12 μg/mL rPro浸潤(rùn)處理、未處理的蝦尾5 g，用干凈剪刀將其剪爛細(xì)碎，放入放入盛有50 mL三角瓶，加入50 mL去離子水，攪勻不時(shí)振蕩，浸漬30 min后過(guò)濾，留取濾液冰箱4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑑?chǔ)存時(shí)間不宜過(guò)久。將盛有10 mL 2%硼酸溶液的燒杯中加入5滴指示液置于冷凝管下端，并將冷凝管下端插入到燒杯吸收液液面以下。吸取樣品濾液于蒸餾瓶?jī)?nèi)，加入5 mL 1%氧化鎂，迅速加上塞子，密閉封緊，并在冷靜管外端包上棉花，加熱蒸餾30 min停止蒸餾，吸收液用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，待終點(diǎn)為藍(lán)紫色停止滴定。記錄好鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量。同時(shí)做無(wú)rPro的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)和以Sigma公司購(gòu)買(mǎi)的天然提取的硫酸魚(yú)精蛋白（Pro）陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量計(jì)算的揮發(fā)性鹽基氮的含量（TVB-N）。稱(chēng)取經(jīng)21.12 μg/mL rPro浸潤(rùn)處理、未處理的蝦尾5 g，將其剪碎放入研缽，將樣品研成肉泥，加入50 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬筮^(guò)濾取濾液。同時(shí)做無(wú)rPro的空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)和以Sigma公司購(gòu)買(mǎi)的天然提取的硫酸魚(yú)精蛋白（Pro）陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。測(cè)量其pH。

2 結(jié)果

2.1 pET22b-CYGBm的構(gòu)建與CYGBm的表達(dá)

如圖1所示，經(jīng)過(guò)3次重疊延伸PCR定點(diǎn)突變，將CYGB基因內(nèi)部的甲硫氨酸對(duì)應(yīng)的密碼子ATG全部突變?yōu)楫惲涟彼釋?duì)應(yīng)的密碼子ATC（起始密碼子除外）獲得CYGBm。將質(zhì)粒pET22b-CYGBm轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，挑選單克隆菌落乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)。結(jié)果表明，突變后的CYGBm其表達(dá)量與CYGB一樣仍可在原核表達(dá)系統(tǒng)中高表達(dá)（圖 2）。

2.2 pET22b-CYGBm-Pro的構(gòu)建、表達(dá)與rPro純化

CYGBm基 因 為 570 bp，Pro基 因 為 99 bp，CYGBm-Pro基因理論長(zhǎng)度約為669 bp。如圖3結(jié)果所示，陽(yáng)性單克隆菌落PCR產(chǎn)物核酸電泳條帶和pET22b-CYGBm-Pro質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物核酸電泳條帶與法與其基因理論長(zhǎng)度相吻合。將質(zhì)粒pET22b-CYGBm-Pro轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，挑選單克隆菌落乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)。結(jié)果表明，乳糖誘導(dǎo)后在全菌和菌體裂解液離心沉淀中，在26 kD左右有明顯的條帶，說(shuō)明CYGBm-Pro融合蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)以包涵體形式高表達(dá)（圖4）。經(jīng)BandScan軟件對(duì)圖4蛋白電泳泳道2進(jìn)行灰度分析融合蛋白CYGBm-Pro表達(dá)率超過(guò)10%。CYGBm-Pro包涵體經(jīng)離心、洗滌、變性、Sephadex G-25凝膠復(fù)性、肝素瓊脂糖凝膠層析柱純化、CM陽(yáng)離子瓊脂糖凝膠層析柱分離純化（圖4，5：純化的CYGBPro）。融合蛋白CYGBm-Pro純化收率為25%。純化的CYGB-Pro CNBr裂解（裂解率為75%）、Sephadex G-25凝膠過(guò)濾，即得純化的rPro（圖4，6：純化的rPro）。目的蛋白rPro總收率為17.5%，總收率偏低，主要原因在于融合蛋白CYGBm-Pro是以包涵體形式表達(dá)，包涵體的復(fù)性一般都很低。

圖3 重組質(zhì)粒pET22b-CYGBm-Pro PCR法和雙酶切法核酸電泳圖Fig. 3 Nucleic acid electrophoresis of recombinant plasmid pET22 B-CYGBm-Pro by PCR and double enzyme digestions

圖4 CYGBm-Pro表達(dá)以及純化的CYGBm-Pro和rPro的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE of CYGBm-Pro expression and purified CYGBm-Pro and rPro

2.3 rPro對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用

如圖5所示，rPro對(duì)普通的大腸桿菌、耐藥的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、真核生物畢赤酵母GS115均有明顯的抑菌活性，且純化的rPro濃度越高，抑菌活性越強(qiáng)，從而證明了通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的rPro具有抑菌活性。

圖5 不同濃度rPro對(duì)不同細(xì)菌生長(zhǎng)抑制率曲線圖Fig. 5 Curves of growth inhibition rates of different bacteria with different concentrations of rPro

2.4 rPro對(duì)鮮蝦的保鮮應(yīng)用效果

鮮蝦儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)腐變，腐變程度可通過(guò)pH、TVB-N監(jiān)測(cè)，一般鮮蝦pH＞7、TVB-N＞20 mg/100，不可食用。每24 h測(cè)經(jīng)rPro處理、天然Pro處理和未處理的pH、TVB-N。結(jié)果表明：rPro處理樣品比未經(jīng)處理樣品在4℃儲(chǔ)存時(shí)間更長(zhǎng)，其效果與天然Pro處理樣品幾乎相當(dāng)，具有一定的保鮮效果（圖6）。

圖6 rPro處理蝦儲(chǔ)存期間pH值（A）和TVB-N值（B）變化曲線圖Fig. 6 Curves of pH values（A）and TVB-N values（B）of shrimp treated by rPro during storage

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)天然提取制備魚(yú)精蛋白［14-15］。雖然魚(yú)精蛋白已從多種魚(yú)類(lèi)及其它水生動(dòng)物中提取得到，但產(chǎn)量十分有限。精蛋白富含精氨酸，而且大多是由AGA或AGG這兩個(gè)大腸桿菌稀有密碼子編碼的；另外，精蛋白具有較為廣譜的抗菌能力，在菌體外加入精蛋白，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁裂解，使細(xì)菌死亡。因此，精蛋白在大腸桿菌中是難以直接表達(dá)的［3，13］。目前精蛋白在大腸桿菌中主要是以融合蛋白形式表達(dá)。王靜等［16］利用牛β-防御素LAP 和牛CATHL2 抗菌肽融合成功的高表達(dá)抗菌肽，張雅麗等［13］在大腸桿菌中融合表達(dá)牛精蛋白，王昊等［17］在大腸桿菌中融合表達(dá)抗惡性黑素瘤單鏈抗體-魚(yú)精蛋白，孟艷玲等［18］在大腸桿菌中融合表達(dá)人抗HBsAg單鏈抗體/魚(yú)精蛋白截短體融合蛋自。本研究采用基因工程方法制備魚(yú)精蛋白，選取鮭魚(yú)魚(yú)精蛋白，依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化并合成了Pro基因序列。不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛(ài)性，密碼子偏愛(ài)性對(duì)重組蛋白質(zhì)的異源表達(dá)具有重要影響。從生物學(xué)基礎(chǔ)來(lái)看，不同的密碼子使用密碼子模式不同的形成可能與基因的GC含量有關(guān)。在生物中高表達(dá)的基因密碼子的使用偏性一般比較大。這些偏好可能與兩個(gè)原因有關(guān)：一是避免使用類(lèi)似終止密碼子的密碼子；二是這些偏好能夠有效地翻譯密碼子，因?yàn)檫@些密碼子對(duì)應(yīng)于生物體中非常豐富的tRNA［19-20］。采用PCR定點(diǎn)突變的技術(shù)，將CYGB中甲硫氨酸位點(diǎn)ATG（除起始密碼子）全部突變?yōu)锳TC，成功獲得CYGBm。CYGBm 融合成功的高表達(dá)了CYGBm-Pro。研究發(fā)現(xiàn)CYGBm-Pro融合蛋白以包涵體形式大量表達(dá)。經(jīng)Sephadex G-25凝膠復(fù)性、肝素親和層析和陽(yáng)離子交換層析，獲得了純度較高的CYGBm-Pro。CYGBm-Pro經(jīng)CNBr 裂解及進(jìn)一步純化后得純化的rPro。通過(guò)試管培養(yǎng)法對(duì)所得rPro蛋白抗菌活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)所選的革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽(yáng)性枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌以及真核生物巴斯德畢赤酵母 GS115 均有顯著的抗菌活性，對(duì)鮮蝦有明顯的保鮮作用。

4 結(jié)論

本研究利用無(wú)甲硫氨酸位點(diǎn)（除起始密碼子）的 CYGBm與魚(yú)精蛋白融合成功的制備了有明顯抗菌活性的重組魚(yú)精蛋白。不僅有較高的表達(dá)量，更有利于CYGBm-Pro的CNBr裂解，提高rPro總的收率，為工業(yè)化生產(chǎn)重組魚(yú)精蛋白提供了一條新思路。