基于新型磁分離技術的高分辨率DNA片段篩選技術

劉瑩 程立 張博

（南方科技大學生物醫學工程系，深圳 518055）

腫瘤、出生缺陷和自身免疫缺陷型疾病是全世界都面臨的難題，且這類疾病的致死率極高，嚴重威脅國民生命健康［1-2］。目前針對這類疾病還缺乏行之有效的治療手段，因此對這類疾病的早期檢測意義非凡。但目前可用的早期檢測方法十分局限：有創檢測方法［3-4］檢測率雖高但操作復雜且有較大副作用，一些生物標記物［5-6］的檢測雖操作簡單但準確率不高，因此建立一種無創、快速、準確的早期檢測方法，對于提前檢測這類疾病，降低其死亡率、提高公眾健康水平具有重要的意義。

游離核酸（cell free DNA，cfDNA）最初是在人體外周血中發現，在過去的幾十年中從尿液、腦脊液和胸膜液中也提取出了cfDNA［7-10］。基于游離核酸的液體活檢技術因其無創性極大地減輕了患者檢測過程中的痛苦和風險，其結果分析基于核酸的測序技術，因此分析結果精準且信息全面有說服力。與之相比，基于CRISPR-Cas系統［11］等檢測技術成本較高，只能針對單一序列進行檢測和分析，通量低且難以實現全面的檢測；而基于血清標志物［12］的檢測方法雖操作簡單，但僅對部分遺傳病有效，限制了其應用范圍，且血清標志物檢測的特異性有一定局限性。經大量研究證明，來源于胎兒、腫瘤組織的cfDNA極大地促進了無創產前診斷和液體活檢領域及其他潛在應用的發展［2，13-14］。

人體外周血中存在著不同片段大小的cfDNA，cfDNA不僅是檢測人體內腫瘤、胎兒發育情況和自身免疫缺陷疾病等重要的生物分子目標，更能夠提供供體基因組的相關信息，對于疾病的檢測分析有著重要意義［15-18］。之前研究發現，孕婦血漿中來源于胎兒的cfDNA、腫瘤患者血漿中與腫瘤相關的cfDNA和自身免疫缺陷患者的cfDNA與健康人血漿中的cfDNA在片段大小上均有所差異。健康人血漿中cfDNA主峰的平均長度為l66 bp，而經序列比對，來源于胎兒的cfDNA、與腫瘤相關的cfDNA和自身免疫缺陷疾病患者的cfDNA表現為在166 bp左右的主峰降低，而150 bp以下的DNA片段比例有所增加［19-20］。造成這種片段長度差異的原因很可能是該類cfDNA甲基化水平較低，相較于來自造血組織等高甲基化的cfDNA更容易被核酸酶水解［21］。

基于所要研究的目標cfDNA（如胎兒的cfDNA、腫瘤相關的cfDNA和免疫缺陷患者體內的cfDNA）與正常的cfDNA在片段長度上的差異，原則上可以通過這種片段長度的差異對目標cfDNA進行富集。常規的富集方法主要為電泳法［22］和色譜法［23］，但這兩種方法在成本、效率、敏感性和特異性方面均有一定的局限性，且由于操作繁瑣、結果一致性差（依賴于操作者的判斷）以及難以實現高通量運行而難以應用于臨床。

本研究通過發展一種基于新型磁性納米微粒的DNA片段篩選技術，利用磁分離法從樣本根源上實現了短片段DNA的富集（操作流程如圖1），與傳統的電泳和色譜分離技術相比，這一技術成本低，耗時短，操作簡單且回收效率高，未來更有可能實現高通量和自動化。篩選效果經由臨床樣本驗證，通過分離富集150 bp以下短片段DNA，這一技術能夠在孕婦血漿樣本中，相較于母體的cfDNA，更多地富集胎兒的cfDNA。富集后的胎兒cfDNA可用于進一步測序分析，經過富集處理，大大減少了母體背景DNA的干擾，這一進步改善了現有方法因胎兒cfDNA比例過低而導致的假陰性結果，能夠提高無創產前診斷的靈敏度和特異性。

圖1 富集短片段DNA的流程圖Fig. 1 Workflow of short DNA fragments enrichment

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清購自 Invintrogen（Gibco（26140-079）），孕婦血漿樣本來源于中國科學院大學附屬深圳醫院兒科的10名孕婦（未知胎兒性別）以及深圳市龍崗區婦幼保健院的14名孕婦（已確定胎兒男性），所有實驗均按照《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》進行，并經南方科技大學倫理委員會批準，本研究的受試者均獲得知情同意。糖原（glycogen）購自VETEC（900925-5G），異丙醇購自MACKLIN麥克林（E809056-500 mL），聚乙二醇（PEG）、無水乙醇、TE buffer（pH9.0）均購自上海滬試。引物及探針設計選擇X、Y染色體特異性相關片段［24］，所用引物及探針均由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 羧基磁珠和羥基磁珠制備 磁珠制備及表面修飾參考文獻［25-26］。

1.2.2 DNA片段篩選 長片段DNA分離：首先取10 μL 從血漿中提取的 cfDNA，與 16 μL（1.6 × 條件，即羧基磁珠體積∶cfDNA樣本體積=1.6∶1）羧基磁珠（分散于PEG）混合于1.5 mL離心管，用渦旋振蕩器混勻后靜置5 min進行孵育，孵育結束后離心5 s，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清，將上清液轉移至一個新的1.5 mL離心管中；短片段DNA回收：于上清液中加入4 μL糖原和8 μL羥基磁珠（分散于TE buffer），用渦旋振蕩器混勻后加入46.4 μL異丙醇，然后在渦旋振蕩器上渦旋10 min，孵育結束后離心5 s，然后將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清后，棄去上清液，對上述步驟所得到的羧基磁珠和羥基磁珠分別進行兩次洗滌，每次使用1 mL 80%乙醇，渦旋30 s后離心5 s，置于磁力架上靜置2 min后棄上清液，兩次洗滌后將磁珠靜置晾干3 min后洗脫；產物洗脫：分別向裝有羥基磁珠和羧基磁珠的離心管中加入10 μL洗脫液（TE bufffer，pH 9.0），渦旋5 min后離心5 s，在磁力架上靜置3 min后，分別取上清到新的1.5 mL離心管，并置于-20℃冰箱保存（短期保存可置于4℃冰箱）。根據樣本體積、篩選片段閾值不同，體系內各組分可等比例擴大。所得產物用2100分析儀（安捷倫）進行DNA片段分布分析。

1.2.3 二次DNA片段篩選（優化后） 第一步長片段DNA分離：首先取10 μL從血漿中提取的cfDNA，與10 μL（1.0×條件，即羧基磁珠體積∶cfDNA樣本體積=1∶1）羧基磁珠（分散于PEG）混合于1.5 mL離心管，用渦旋振蕩器混勻后靜置5 min進行孵育，孵育結束后離心5 s，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清，將上清液轉移至一個新的1.5 mL離心管中；第二步長片段DNA分離：于上清液中加入2 μL（0.2×條件，即羧基磁珠體積∶cfDNA樣本體積=0.2∶1）羧基磁珠（分散于PEG），用渦旋振蕩器混勻后靜置5 min進行孵育，孵育結束后離心5 s，將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清，將上清液轉移至一個新的1.5 mL離心管中；短片段DNA回收：于上清液中加入4 μL糖原和8 μL羥基磁珠（分散于TE buffer），用渦旋振蕩器混勻后加入41.6 μL異丙醇，然后在渦旋振蕩器上渦旋10 min，孵育結束后離心5 s，然后將離心管置于磁力架上靜置3 min，待上清液澄清后，棄去上清液。對上述步驟所得到的羧基磁珠和羥基磁珠分別進行兩次洗滌，每次使用1 mL 80%乙醇，渦旋30 s后離心5 s，置于磁力架上靜置2 min后棄上清液，兩次洗滌后將磁珠靜置晾干3 min后洗脫；洗脫：分別向裝有羥基磁珠和兩步羧基磁珠的離心管中加入 10 μL洗脫液（TE bufffer，pH 9.0），渦旋 5 min后離心5 s，在磁力架上靜置3 min后，分別取上清到新的1.5 mL離心管，并置于-20℃冰箱保存（短期保存可置于4℃冰箱）。根據樣本體積、篩選片段閾值不同，體系內各組分可等比例擴大。所得產物用2100分析儀（安捷倫）進行DNA片段分布分析。

1.2.4 臨床樣本的富集驗證 胎兒性別驗證：將得到的孕婦血液樣本進行血漿分離，然后提取血漿樣本中的cfDNA。當孕婦所懷胎兒為男性時，血漿所提取cfDNA中的Y染色體相關片段則均來源于胎兒。由于各條染色體在cfDNA中所占比例相對穩定，因此可以通過樣本中Y染色體的比例來估算胎兒cfDNA與母體cfDNA的比例。胎兒性別的確定是基于對母體血漿中提取的cfDNA進行Y染色體相關片段的實時qPCR（TaqMan）測定。qPCR反應混合物（總體積 10 μL），其中包含 5 μL TaqManTMFast Advanced Master Mix（Thermo Fisher）、Y 染色體正向和反向引物（各 0.5 μL 引物序列見表 1）、0.5 μL TaqMan-MGB探針（VIC熒光染料，10 μmol/L，序列 見 表 1）、1 μL DNA 樣 本 和 2.5 μL 不 含 RNase /DNase的水。在StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上運行程序為：95℃ 10 min；60℃1 min 然后95℃ 15 s 循環39次；60℃ 2 min，循環結束后于10℃保存，所有步驟的升溫速率均為2℃/s，Ct值＜ 38的樣本被認定為男性胎兒。

表1 引物和探針信息表Table 1 Information of primers and probes

1.2.5 胎兒cfDNA富集 對后續認定為男性胎兒的21個樣本進行DNA片段篩選，長短片段篩選閾值設定為150 bp，篩選方法如1.2.2，富集前后樣本使用數字PCR（ddPCR）進行胎兒cfDNA與母體cfDNA比例的分析。

1.2.6 胎兒cfDNA比例變化測定 ddPCR反應混合物總體積為14.5 μL，其中包含7.25 μL QuantStudioTM3D數字PCR預混液（Thermo Fisher Scientific），X染色體和Y染色體相關片段正向、反向引物和對應探針（引物及探針序列見表1，X染色體相關片段熒光標記為FAM，Y染色體相關片段熒光標記為VIC）各為 0.725 μL（10 μmol/L），1.45 μL DNA 樣本和3.625 μL不含RNase/DNase的水。使用ProFlexTM2× Flat PCR系統（Thermo Fisher Scientific）進行ddPCR。熱循環條件如下：96℃ 10 min；60℃ 1 min然后98℃ 30 s 循環39次；60℃ 2 min，循環結束后于10℃保存，所有步驟的升溫速率均為2℃/s。循環結束后，使用QuantStudioTM3D Analysis SuiteTM軟件分析孔中所擴增得到的熒光信號。胎兒cfDNA比例以ChrY%）計算：ChrY%= Chr Y的拷貝數/（Chr X的拷貝數+ Chr Y的拷貝數）。

2 結果

2.1 利用新型磁分離技術的DNA片段篩選結果

首先使用胎牛血清所提取的cfDNA進行模型體系驗證。所得產物經2100分析儀High sensitive DNA模式進行分析，從圖2-A上可以看出，相較于富集前，經過富集后的cfDNA主峰左移并且峰值下降，富集后的cfDNA不含有長片段DNA。從圖2-B的定量數據分析來看，150 bp以下的DNA片段在富集前后從7.1%增加到36.4%，主峰的平均片段大小從174 bp下降為151 bp，這表明這一方法能夠顯著提高樣本中150 bp以下cfDNA的比例。

圖2 cfDNA短片段富集的模型體系驗證Fig.2 Verification of short DNA fragments enrichment

2.2 臨床樣本的富集驗證結果

ddPCR對X、Y染色體的拷貝數檢測流程見圖3-A。其中只檢測到X染色體相關片段擴增的孔用藍色點表示，只檢測到Y染色體相關片段擴增的孔用紅色點表示，同時檢測到X染色體和Y染色體相關片段擴增的孔用綠色點表示，而未檢測到擴增的孔用黃色點表示（圖3-B）。圖中二維ddPCR熒光幅值圖顯示富集前后樣本中X染色體和Y染色體相關片段的大致變化，在富集后X染色體的陽性孔數明顯減少，而Y染色體的陽性孔數幾乎保持不變，這證明了富集后Y染色體比例的增加（圖3-B）。后續對21個樣本的ddPCR結果進行定量數據分析發現，在富集前后各個樣本的Y染色體比例都有顯著提高，富集后Y染色體比例提高大約為富集前的3.2倍（圖3-C和D）。

圖3 ddPCR驗證結果Fig.3 Enrichment efficiency evaluation by ddPCR

3 討論

調研已有研究發現，現有的高分辨率的對DNA片段篩選和分離的方法操作繁瑣且通量低，目前市面上還未有操作簡單、可重復性高、可實現自動化的DNA片段高分辨率篩選方法，尤其是針對200 bp以下短片段DNA的篩選。本文所介紹的這種基于新型磁分離技術的DNA片段篩選克服了已有方法的弊端，并且可實現自動化和高通量的篩選，未來在臨床應用上具有極大的潛力。

首先以胎牛血清中提取的cfDNA作為模型體系，從理論上證明了這一技術實現200 bp以下cfDNA片段高分辨率篩選的可行性。圖2中的數據證明，富集后的cfDNA能夠完全去除200 bp以上的長片段DNA，且富集后150 bp以下短片段DNA的占比增加近5倍，證明了這一技術能夠實現150 bp以下短片段DNA的富集，這對于未來應用于臨床十分重要。之后通過對臨床孕婦血漿樣本中的cfDNA進行富集，并利用ddPCR的分析方法，我們證明了這一技術能夠顯著提高孕婦血漿樣本中胎兒cfDNA（基于樣本中來源于男性胎兒Y染色體相關片段比例的變化）的比例，初步探索了這一技術在無創產前診斷領域應用的前景（圖3）。

基于實驗結果，發現在羧基磁珠與樣本體積比為1.6∶1時，雖能夠很好的富集150 bp以下短片段的DNA，但如圖2-A所示，富集后的cfDNA主峰大幅降低，在去除長片段DNA背景干擾的同時，也可能導致臨床樣本中目標DNA的損失，從而導致關鍵信息的缺失進而引起檢測結果的不準確，這對于無創產前診斷中單基因遺傳病的篩查［27-29］、液體活檢早期篩查［30-31］和免疫缺陷疾病的診斷［10］均十分重要，尤其在腫瘤的早期檢測中，由于ctDNA（circlating tumor DNA）含量極低（僅為cfDNA的0.1‰-1‰）［30，32］，過多 150 bp 以下 cfDNA 的損失很可能造成檢測結果的假陰性。為了平衡短片段DNA的回收率和富集效率，我們將上述篩選方案進行了優化，在一步篩選的基礎上降低羧基磁珠的用量，并調整為兩次篩選（圖4）。

圖4 優化后富集短片段DNA的流程圖Fig.4 Optimized workflow of short DNA fragments enrichment

二次篩選方法將羧基磁珠與樣本體積比從1.6∶1調整為第一步1∶1篩選（如圖4中第一步長片段DNA分離），第二步0.2∶1篩選（如圖4中第二步長片段DNA分離），通過降低羧基磁珠的用量來減少短片段DNA的損失，并將原本的一次篩選去除長片段DNA優化為二次篩選，進而提高短片段DNA的富集效率。具體步驟見1.2.3。結果如圖5，圖5-B中兩步長片段DNA分離結果表明，優化后的兩次篩選起峰位置均在150 bp左右，即最大程度上保留了150 bp以下的cfDNA。圖5-C和5-D中150 bp以下DNA片段占比富集前后提高近4倍，主峰的平均長度從177 bp降至161 bp，優化后的富集方法盡可能地減少了150 bp以下cfDNA的損失，并顯著提高了短片段cfDNA的比例，這對于未來將其應用于腫瘤的早期篩查、免疫缺陷型疾病的診斷以及無創產前診斷中單基因遺傳病的篩查具有重要意義。

圖5 優化后胎牛血清cfDNA短片段的富集Fig. 5 Enrichment of short cfDNA fragments with fetal bovine serum by optimized workflow

經實驗證明，優化后的二次篩選能夠有效減少150 bp以下DNA片段的損失，這對于未來臨床上癌癥的早期篩查和自身免疫缺陷疾病的診斷具有很大的應用潛力。已知在腫瘤患者血漿中ctDNA的含量非常低［33］；同樣在自身免疫缺陷疾病，如在系統性紅斑狼瘡患者外周血中發現存在更多150 bp以下的cfDNA［34］，但大量的長片段cfDNA作為背景極大地干擾了相關靶標DNA的信號；而當前的無創產前診斷只能實現胎兒染色體異常的檢測，還未能實現單基因遺傳病等的早期篩查［35］，均是由于目標DNA豐度太低，檢測靈敏度和準確度受限于背景信號的干擾。在這些臨床應用領域中，由于靶標DNA均存在片段偏小（＜150 bp），且含量極低的問題，因此可以利用二次篩選技術從樣本根源上富集150 bp以下的DNA，并盡可能減少短片段DNA的損失。經二次篩選后，基于新型磁分離技術的DNA片段篩選技術能夠實現最大程度地減少目標長度DNA片段的損失，并顯著地提高150 bp以下DNA片段在樣本中的占比，保證了臨床信息的完整性。且操作簡單，一致性好，可自動化程度高，未來更可結合自動化實現高通量篩選。

與其他同類技術以及傳統的色譜法和電泳法核酸分離技術相比，這一技術操作簡單，耗時短，且可自動化程度高。在基于SPRI的DNA片段篩選技術中實現了技術突破，已經達到了10-20 bp的分辨率差別，其篩選分辨率還有進一步提高的空間。當前這一技術僅應用于小體積樣本的DNA片段篩選，未來通過磁珠的磁分離屬性，可應用于高通量的自動化篩選，相應的技術路線還需要進行進一步的驗證和調整。未來將這項高分辨率的DNA片段篩選技術與測序等技術相結合，有希望解決無創產前診斷、液體活檢和免疫缺陷型疾病早篩中樣本信噪比低、靈敏度差的問題，對于如測序建庫前的DNA片段篩選也具有應用潛力，運用磁分離技術對提高測序建庫效率和節省成本有一定的推動作用，使基于測序的疾病早篩進入更深層次的領域，更有助于提高公眾健康水平。

4 結論

本研究基于一種新型的磁分離技術，實現了高分辨率的短片段DNA的富集。經多次實驗及優化證明，這一技術能夠盡可能降低150 bp以下短片段DNA的損失，并能夠顯著提高樣本中150 bp以下短片段DNA的比例。這項技術在未來有可能更多地應用于包括測序建庫、無創產前診斷、液體活檢、免疫缺陷型疾病早篩等方向。

致謝

感謝中國科學院大學附屬深圳醫院及深圳市龍崗區婦幼保健院所提供的孕婦血漿樣本。