一株微桿菌CBA01對球形棕囊藻的溶藻特性與生理響應研究

王靈 向文洲 衛華寧 呂金亭 吳華蓮 吳后波

（1. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室 廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣州 511458；4. 中國科學院南海生態環境工程創新研究院，廣州 510301）

隨著社會經濟的快速發展，工業化和城市化的迅速推進，海洋水體的污染和富營養化日趨嚴重，其中最顯著的就是赤潮爆發的頻率和規模也逐漸呈現增長趨勢［1］。赤潮發生后，嚴重危害海水養殖業和漁業資源，導致海洋環境惡化從而嚴重破壞海洋生態系統［2］。棕囊藻（Phaeocystis）是一種廣溫廣鹽性的定鞭金藻，廣泛分布在我國沿海海域，是我國南海海域頻繁爆發赤潮的藻種之一［3］。近年來，我國沿海地區棕囊藻引發的赤潮頻繁爆發，棕囊藻藻體含有的膠質和糖的囊體會緊緊貼在魚鰓上，引起魚類窒息死亡，同時分泌溶血毒素破壞水體環境，影響近海魚蝦養殖，造成重大經濟損失［4］。因此，解決棕囊藻赤潮危機也成為了當前海洋環境研究的重點問題。

目前，治理赤潮普遍采用傳統的物理和化學方法，如機械除藻、使用化學除藻藥劑等方法。然而這些傳統方法卻存在諸多因素的限制，如成本、安全性等，且治理效率低易造成二次污染［5-7］。隨著對赤潮防治研究的深入，人們漸漸發現海洋細菌對藻類的生長發育起著潛在的調控作用。在利用傳統的物理和化學方法防治效果收效甚微的情況下，人們開始把研究重點轉移到海洋細菌上，通過細菌溶藻來抑制藻體生物量，從而抑制有害藻華的爆發［8-9］。如今，溶藻細菌作為赤潮防治的新方法，開始引起國內外研究人員的廣泛關注。目前關于溶藻細菌如何裂解藻細胞進行溶藻的機理以及溶藻細菌中具有溶藻作用的活性物質的分離鑒定都仍處于研究階段［10］。因此，研究溶藻細菌對球形棕囊藻的作用機制對當前生物防治赤潮爆發具有重要意義。

本課題組之前從位于海南省三亞市天涯鎮的能源綠藻Picochlorum sp. SCSIO-45015開放池中，分離出一株入侵生物藍細菌Cyanobacterium sp SCSIO-45682［11］。經實驗室前期研究發現在該藍細菌培養物對微藻的侵染過程中，起主導作用的不是藍細菌自身，而是附生于該藍細菌的多株細菌。實驗室前期已探究了一株對鹽生杜氏藻有強烈溶藻作用的細菌CBA02［11］。本研究將對另一株同樣具有溶藻效應的細菌CBA01的溶藻特性及其作用機制展開研究。經實驗室前期研究，初步鑒定其為微桿菌屬Microbacterium sp. CBA01，且在對該株菌溶藻范圍的廣譜性測定中發現該菌對球形棕囊藻Phaeocystis globosa SCSIO-45315具有強烈的溶藻效應。因此，本研究以球形棕囊藻為研究對象，對細菌CBA01的溶藻特性和溶藻機制進行初步探究，確定其溶藻方式及溶藻活性特性，并測定了該菌株在溶藻過程中藻細胞生理活性變化，初步揭示其作用機制，為生物防治赤潮奠定理論基礎。此外，該株溶藻菌發現于微藻戶外養殖池中，對其溶藻機制的挖掘，也有效推動了防治微藻大規模養殖中溶藻菌入侵污染的技術研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株CBA01為實驗室分離得到的藍細菌Cyanobacterium sp. SCSIO-45682的共附生細菌，屬微桿菌（Microbacterium sp.）。該藍細菌于2013年由本實驗室從海南省三亞市天涯鎮的被污染微藻開放養殖池中分離獲得。實驗藻種球形棕囊藻Phaeocystis globosa SCSIO-45315藻種由中國科學院南海海洋研究所經濟微藻種質庫提供。

1.2 方法

1.2.1 藻株的培養方法 菌株CBA01培養采用2216E培養基［12-13］，于 28℃，200 r/min 條件下培養。實驗所用藻種均采用 F/2 培養基［14］，于溫度25±1℃、光照強度 4 000 lx、光暗比12 h∶12 h條件下培養。

1.2.2 菌株CBA01生長曲線的測定 挑取固體培養基上的菌株CBA01單菌落接種至2216E液體培養基中，設置3組平行，28℃、200 r/min 振蕩培養。每12 h取樣測定OD600，用測定的數據構建細菌的生長曲線，分析各生長階段。

1.2.3 葉綠素a含量和溶藻率的測定 采用丙酮法測定葉綠素a的含量［15］。溶藻率計算公式：

其中，CC表示對照組葉綠素濃度，CT表示實驗處理組葉綠素濃度。

1.2.4 菌株CBA01的溶藻效應研究

1.2.4.1 不同發酵時間的菌液對溶藻活性的影響 分別取5 mL培養了24 h、48 h、72 h、120 h、192 h、240 h的CBA01菌液加入到100 mL處于對數生長期的球形棕囊藻藻液中，以在藻液中加入等量 2216E 培養基作為空白對照組，每組設2個平行，于溫度（25±1）℃、光照強度 4 000 lx、光暗比12 h∶12 h條件下培養。藻菌共培養，每隔2 d定時取樣，測定藻液中葉綠素a的含量并計算溶藻率。

1.2.4.2 不同添加量的菌液對溶藻活性的影響 細菌CBA01于2216E液體培養基中培養72 h，分別取2 mL、3 mL、5 mL的菌液量加入到100 mL對數生長期的球形棕囊藻藻液中，空白對照組處理和培養條件同上。藻菌共培養，定時取樣并計算溶藻率。

1.2.4.3 藻液不同初始濃度對溶藻活性的影響 細菌CBA01于2216E液體培養基中培養72 h，分別將球形棕囊藻液的OD680調至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5，各組取100 mL藻液加入5 mL的菌液，空白對照組處理和培養條件同上。藻菌共培養，定時取樣并計算溶藻率。

1.2.4.4 細菌CBA01的溶藻作用方式 細菌CBA01于2216E液體培養基中培養72 h，取菌液10 000 r/min離心10 min，分別收集上清液和細菌菌體。菌體用無菌水洗滌3次后重懸，上清液過0.22 μm 濾膜后4℃冰箱保存待用。分別吸取5 mL原細菌培養液、上清液和菌體重懸液，分別加入到100 mL藻液中，空白對照組處理和培養條件同上。藻菌共培養，定時取樣并計算溶藻率。

1.2.4.5 溫度對細菌CBA01無菌上清液溶藻活性的影響 制備細菌CBA01無菌上清液，分別在30℃、70℃和 100℃水浴以及 121℃高壓蒸汽滅菌鍋中處理30 min，自然冷卻至室溫，并各取5 mL無菌上清液加入到100 mL藻液中，空白對照組處理和培養條件同上。藻菌共培養，定時取樣并計算溶藻率。

1.2.4.6 pH對細菌CBA01無菌上清液溶藻活性的影響 收集細菌CBA01無菌上清液，分別調節其pH至2.0、4.0、6.0、8.0 和 10.0，過夜處理后將其調回初始pH值。并各取5 mL無菌上清液加入到100 mL藻液中，空白對照組處理和培養條件同上。藻菌共培養，定時取樣并計算溶藻率。

1.2.5 細菌CBA01無菌上清液對球形棕囊藻細胞生理活性的影響

1.2.5.1 粗酶液制備 取對數期的球形棕囊藻藻液，加入5 mL的CBA01無菌上清液進行培養，以加入等量 2216E培養基作為空白對照組。分別收集處理0 h、24 h、48 h 的藻液，6 000 r/min、4℃離心10 min，收集藻細胞。將收集的藻細胞重懸于相應勻漿介質中，4℃ 超聲波破碎后細胞勻漿以 6 000 r/min、4℃離心10 min，上清液即為粗酶液［16］。

1.2.5.2 酶活性的測定 細胞抗氧化系統相關的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性均采用相應試劑盒（南京建成生物工程公司、北京百奧萊博科技有限公司）進行測定。

1.2.6 數據處理 本試驗數據統計使用Oringin軟件，用One-way ANOVA分析進行單因素方差分析，所有數據用平均值±標準誤差表示，P＜0.05 表示差異性顯著。

2 結果

2.1 菌株CBA01的生長曲線

每隔12 h取樣，測定菌株Microbacterium sp.CBA01的OD600，繪制生長曲線如圖1所示。從圖1中可以看出，CBA01生長延滯期為0-12 h，對數生長期為12-72 h，72 h后進入穩定期，168 h后進入衰退期。由此可選取細菌濃度較高的穩定期進行后續溶藻相關試驗。

圖1 細菌CAB01的生長曲線Fig. 1 Growth curve of symbiotic bacteria CAB01

2.2 細菌CBA01的溶藻效果

菌液的發酵時間、添加量以及藻液初始濃度都是細菌溶藻作用強度的影響因素。其中細菌CBA01的溶藻作用與發酵時間成正相關（圖2-A），發酵時間為24 h和48 h時溶藻率較低，第6天溶藻率為10.23%±0.99%和37%±0.89%，從72 h后，各組中溶藻率變化趨勢類似，到第6天溶藻率分別為68.48%±0.92%、73.78%±7.55%、74.50%±8.79%和64.58%±1.53%，因此以72 h作為菌液的發酵時間。細菌CBA01的溶藻能力隨菌液添加量增加而增加（圖2-B）。當菌液添加量為2 mL和3 mL時，溶藻率雖在上升但變化幅度不明顯，培養第6天溶藻率僅為14.08%±8.46%和49.63%±1.85%，而添加量為5 mL時，第6天溶藻率達到最大，為88.17%±0.94%，以此作為菌液最適添加量。藻液初始濃度越高，菌株CBA01溶藻效果越不明顯（圖2-C），藻菌培養第6天時，藻液初始OD680為0.1和0.2時，溶藻效果最好，為80.24%±5.43%和59%±0.34%；而藻液初始OD680為0.3、0.4和0.5時，第6天時溶藻率并不明顯，分別為23.05%±9.26%、29.53%±2.08%和20.40%±4.59%。

圖2 菌液不同發酵時間（A）、菌液不同添加量（B）及藻液不同初始濃度（C）對溶藻活性的影響Fig. 2 The effect of different fermentation time (A) and addition amount of bacterial solution (B) and different initial concentration of P. globosa (C) on algicidal activity

2.3 細菌CBA01的溶藻作用方式

為探究溶藻菌對球形棕囊藻的溶藻作用方式，分別對溶藻菌發酵液經離心、過濾收集菌體和無菌上清液的溶藻效果進行測定，結果如圖3所示。實驗結果表明，藻菌共培養過程中，細菌發酵液組與無菌上清液組的溶藻率幾乎同步增長，至培養第6天時，兩組溶藻率分別達到96.06%和95.39%，均顯著性高于細菌菌體組的溶藻率（P＜0.05）。

圖3 菌液不同處理對溶藻活性的影響Fig. 3 The effect of different addition treatment of bacterial solution on algicidal activity

2.4 細菌CBA01無菌上清液溶藻物質的特性

溶藻細菌CBA01的無菌上清液經過不同溫度處理后，如圖4-A所示。對棕囊藻仍表現出較高的溶藻效應，但溶藻活性整體較之前的處理組出現略微下降，尤其是121℃處理組，溶藻率為42.95%±3.88%，其余組別溶藻率變化不大，分別為 51.32%±0.54%、53.22%±3%、53.75%±2.97%。上清液經過不同pH處理后，溶藻效果如圖4-B所示。當pH偏酸性時，各組溶藻率隨pH的增加而增加，且隨藻菌共培養時間而上升，上清濾液pH為 2.0、4.0、6.0時，培養至第6天時溶藻率分別為56.38%±3.96%、64.62%±8.26%、63.64%±0.34%；當pH偏堿性時，CBA01溶藻物質表現出對強堿較敏感，溶藻率顯著降低，上清濾液pH為8.0和10.0時，到第6天溶藻率分別為 53.95%±9.24%和18.13%±4.17%。

圖4 不同溫度（A）和酸堿（B）條件處理后的CBA01無菌上清液對球形棕囊藻的溶藻效果Fig. 4 Algicidal efficiency of CBA01 sterile filtrate treated with different temperature (A) and pH (B)conditions on P. globosa

2.5 細菌CBA01無菌上清液對球形棕囊藻細胞生理活性的影響

MDA作為細胞膜脂過氧化判斷的重要指標，反映了機體細胞膜氧化損傷的程度。加入CBA01無菌上清液處理后，細胞內MDA含量明顯上升，上清液處理48 h時實驗組的MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01）（圖5-A）。SOD能夠清除細胞內超氧陰離子自由基，防止其在細胞內積累，從而對細胞產生危害。添加上清液處理后，藻細胞內 SOD 活性先上升后下降，而對照組的藻液 SOD 活性基本保持不變，培養24 h時，加入無菌上清液的藻液中SOD 的活性是對照組的1.8倍（P＜0.01），48 h時，實驗組SOD活性有所下降，但仍是對照組的1.5倍（P＜0.01）（圖5-B）。POD能催化體內過氧化氫反應，有效降解細胞內H2O2，從而防止H2O2在有機體內積累，導致有機體傷害。加入上清液處理后，POD活性呈逐漸升高的趨勢，實驗組均顯著高于對照組，且處理24 h和24 h 后活性分別升高至對照組的13.89倍和32.71倍（P＜0.01）（圖 5-C）。

圖5 無菌上清液對球形棕囊藻細胞抗氧化系統相關酶活性的影響Fig. 5 Effect of sterile supernatant on the activity of antioxidant enzymes of P. globosa cells

2.6 葉綠素a含量的測定

CBA01無菌上清液對球形棕囊藻葉綠素a含量的影響見圖6。隨共培養時間的增加，經上清液處理的藻液葉綠素a含量逐漸降低，至培養第6天時，葉綠素a含量降到最低為（0.14±0.01）μg/mL，較對照組下降95%（P＜0.01）。結果表明，溶藻物質會破壞藻細胞的光合作用活性，影響光合作用效果，最終導致藻細胞缺少能量供給而死亡。

圖6 無菌上清液對球形棕囊藻細胞葉綠素a含量的影響Fig 6 Effect of sterile supernatant on chlorophyll a activity of P. globosa cells

3 討論

3.1 溶藻細菌與赤潮的生物防治

有害藻華目前已成為全球性的海洋生態問題，對海洋環境、漁業養殖以及人類健康等都造成了嚴重威脅。近年來許多研究表明，將這類可抑制藻細胞生長，溶裂或殺死藻細胞的細菌稱為溶藻細菌，將這種特性稱為溶藻特性，但在部分文獻中，也有用殺藻活性來表示［17-18］。由于這類細菌易培養，能高效裂解藻細胞，安全性高等特性，深入研究溶藻細菌對藻類的溶藻特性以及作用機理有助于開發經濟高效、環境友好型生物除藻劑，現已成為當今生物防治赤潮的研究熱點。

球形棕囊藻作為有害藻華的代表藻種之一，國內外目前有關細菌對球形棕囊藻的溶藻作用研究相對較少，已有報道溶藻細菌多為鏈霉菌屬（Streptomyces）、 芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus） 等［19-21］。Zhang等［22］分離出一株鏈霉菌屬RPS（Streptomyces alboflavus RPS）通過分泌胞外活性物質能抑制球形棕囊藻鞭毛活性，致使其鞭毛脫落而裂解死亡。Tan等［18］發現芽孢桿菌Ts-12（Bacillus sp. Ts-12）可分泌一種環肽對球形棕囊藻表現出顯著的殺藻活性。陳麗娜報道了一株芽孢桿菌B1分泌的L-組氨酸對球形棕囊藻有明顯的溶藻效果［23］。本研究首次報道了從藍細菌中分離出的一株對球形棕囊藻具有很強的溶藻能力的菌株CBA01，該菌屬于放線菌類群（Actinobacteria）中的微桿菌屬（Microbacterium sp.），這進一步豐富了球形棕囊藻的溶藻細菌資源庫，有助于開發綜合性多樣化的新型生物除藻劑，這對赤潮生物防治有重要的意義和應用前景。

3.2 菌株CBA01的溶藻特性及溶藻機制

已有研究表明，溶藻細菌的溶藻特性受光照、溫度、pH、培養時間、菌和藻的生長狀態等多種因素的影響［24］。本研究首先對菌株CBA01菌液的溶藻特性進行了初步分析，摸索CBA01菌液達到最佳溶藻活性的測試條件，為進一步揭示溶藻作用機理奠定基礎。結果發現在一定范圍內，細菌的溶藻作用效應與菌液發酵時間、菌液添加量成正相關關系，隨著菌液發酵時間的增長和菌液濃度提高，溶藻效應隨之提高；而細菌的溶藻效應與藻細胞初始濃度成負相關，藻細胞初始濃度越高，溶藻效應越差。

在最適溶藻效應條件下，本文進一步對溶藻活性的成分進行了確定。相關研究報道，溶藻細菌主要通過直接溶藻和間接溶藻兩種方式進行溶藻作用，兩者區別在于，前者是細菌直接接觸藻細胞表明或侵入細胞內導致藻細胞死亡，后者是細菌分泌胞外活性物質抑制或溶解藻細胞［25-26］。Imai等［27］1993年發現的一株噬胞纖維菌Cytophaga sp.能直接與藻細胞表面接觸將藍藻殺死。Zhao等［9］從一株Bacillus sp. B1 中分離得到多種能夠殺死球形棕囊藻的活性物質。與前人結果相似，本研究結果表明，上清液溶藻率與對照組細菌發酵液結果相似，遠高于菌體組溶藻率，且在顯微鏡觀察下，菌體處理組藻細胞生長狀態正常，并無明顯溶藻現象，因此初步判斷菌株CBA01通過分泌具有胞外活性物質間接溶藻，而菌體本身并無溶藻作用。同時，對CBA01的無菌上清液進行不同溫度、pH處理，結果表明，CBA01分泌的胞外溶藻物質在高溫處理下仍具有較高的溶藻活性，說明溶藻活性物質具有一定耐高溫性，高溫下不易變形失活，因此初步推測該物質不是易受高溫影響的蛋白質或核酸等生物分子。同時，根據結果分析，pH對CBA01的溶藻活性也有顯著影響，尤其強堿條件下，溶藻效應顯著降低，而酸性條件下，溶藻物質的活性相對穩定，并隨pH的增加而增加，這表明酸堿強度會影響溶藻物質的結構及溶藻活性強度。對細菌CBA01溶藻特性的探索分析，有助于進一步確定溶藻物質的種類和化學結構，為探索細菌CBA01的作用機制奠定基礎。

3.3 溶藻物質對藻細胞生理活性的影響

外界環境刺激會引起機體發生氧化脅迫，細胞內通過自身產生的抗氧化系統（包括酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化物質）清除體內過量的活性氧（ROS）來維持細胞內平衡狀態，以保護機體免受外界環境的損害。通過對細菌CBA01溶藻過程的觀察發現，CBA01溶藻物質會破壞棕囊藻細胞內部，致使細胞膨脹破碎，胞內物質外流，進而細胞死亡。因此，本研究探究了溶藻作用初期藻細胞生理活性的變化，以進一步揭示菌CBA01的溶藻作用機制。

機體通過非酶系統產生ROS，會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化作用。因此作為膜脂過氧化終產物的丙二醛常作為反映機體非酶類抗氧化能力的指標［28］。在本研究結果中，作為細胞膜完整性判斷指標的MDA含量上升，說明溶藻物質作用下，藻細胞細胞膜的脂質過氧化反應加劇，破壞細胞膜的完整性，進而導致藻細胞死亡。SOD作為第一個參與清除活性氧的保護酶，能清除細胞內超氧陰離子自由基［29］。POD能催化體內過氧化氫反應，防止過氧化氫過多累積。本研究中兩種抗氧化酶，在溶藻作用下，酶活性整體呈上升趨勢，表明溶藻物質損傷了球形棕囊藻細胞，刺激藻細胞內產生了過量的有害自由基，機體自身的防御機制開啟，清除體內的有害自由基，因而SOD和POD活性上升。而后SOD活性變化趨勢逐漸減弱，說明隨著有害自由基的不斷積累，超出藻細胞自身修復力，酶活力下降，藻細胞受損程度逐漸加劇甚至死亡，達到溶藻目的。

這一結果也與已有研究結果相似。韓貝貝等［17］研究發現溶藻作用下中肋骨條藻細胞與抗氧化系統相關的MDA含量、SOD、POD的活性顯著上升。牛丹丹等［30］發現溶藻細菌YZ無菌濾液主要是通過降低保護酶活性、加大膜脂過氧化發揮對銅綠微囊藻的溶解作用。綜合上述研究結果，推測溶藻細菌CBA01入侵球形棕囊藻細胞，一方面可能通過刺激藻細胞內短時間產生過量的有害自由基導致細胞內抗氧化系統失衡，從而影響藻細胞膜系統的完整性，改變膜通透性，大量溶藻活性物質進入藻細胞內，最終細胞破裂死亡；另一方面也可能是CBA01溶藻物質本身具有較強的氧化性，產生大量有害自由基，破壞細胞膜系統后進入藻細胞后破壞細胞結構致使細胞死亡。初步確定了CBA01對藻細胞生理活性的影響，但對其溶藻機理的深入研究仍需繼續，可在之后通過檢測溶藻物質是否具有強氧化性來進一步揭示溶藻作用的過程及作用部位。

3.4 溶藻物質對藻細胞光合系統的影響

葉綠素a 能影響光能的吸收與能量轉換，是反映光合作用能力的重要指標［31］。本研究中，溶藻細菌CBA01作用下，棕囊藻細胞葉綠素a含量顯著下降，表明溶藻物質會損傷藻細胞的光合系統，抑制機體有機物供給和能量運輸，影響藻細胞正常生長甚至引起藻細胞死亡。與本文研究結果相似，Hu等［32］研究發現芽孢桿菌 Y4 胞外活性物質會加速球形棕囊藻細胞光合色素分解，葉綠素a 含量顯著下降，影響光合系統Ⅱ光能轉化效率，從而對藻細胞損傷甚至死亡。

4 結論

本研究發現菌株Microbacterium sp. CBA01通過胞外分泌溶藻物質經間接溶藻作用而導致球形棕囊藻的裂解，其分泌的溶藻活性物質能耐高溫、適合酸性或中性環境，且溶藻活性受菌液發酵時間、添加量和藻液初始濃度等因素影響；菌株CBA01分泌的溶藻活性物質在溶藻過程中，刺激藻細胞內產生過量的有害自由基，引起藻細胞應激反應，細胞內抗氧化系統失衡，細胞膜系統氧化損傷改變其通透性，大量胞外物質侵入細胞內導致藻體死亡；同時導致細胞內葉綠素a合成受阻，從而抑制細胞正常生長代謝過程，最終細胞停止分裂，由此形成溶藻效應。