高效液相色譜法同時測定癲癇患兒血清中丙戊酸鈉和2-丙基-4-戊烯酸血藥濃度*

李 賽，蘇凌瓔

（1.揚州大學附屬淮安市婦幼保健院，江蘇 淮安 223000；2.南京醫科大學附屬淮安第一醫院，江蘇 淮安 223000）

丙戊酸鈉（VPA）是治療兒童癲癇的一線藥物[1-2]，肝毒性為VPA最嚴重的不良反應，常見于2歲以下兒童[3-4]。VPA體內代謝產物多達50種，其中由細胞色素P450（CYP450）催化生成的2-丙基-4-戊烯酸（4-ene-VPA）被認為是VPA產生肝毒性的主要物質[5-8]，可抑制線粒體β氧化，引起肝細胞脂質變性，與谷胱甘肽反應，降低機體的抗氧化能力，誘導肝損傷[9-10]。目前，主要采用氣相色譜-質譜聯用法[11]、液相色譜-質譜聯用法[12]及高效液相色譜（HPLC）法測定4-ene-VPA，但前2種方法由于成本過高，不適于在醫療機構廣泛開展。本研究中參考文獻[13]，建立了同時測定癲癇患兒血清中VPA及其代謝產物4-ene-VPA血藥濃度的HPLC法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1220型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；TDL80-2B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；AL104型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.1mg）；WH-3型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；XO-3200D型超聲清洗機（南京先歐儀器制造有限公司，功率為80 W，頻率為40 kHz）；DHG-9101-A型電熱鼓風干燥箱（上海三發科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

VPA口服溶液（賽諾菲＜杭州＞制藥有限公司，批號為AHG0565，規格為每支300 mL∶12 g）；VPA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100963-201101，純度為94.5%）；4-ene-VPA對照品（加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號為1-LIJ-87-2，純度≥98%）；環己甲酸（批號為20120304），2-溴代-4-硝基苯乙酮（批號為20120703），甲醇、乙腈、正己烷、三乙胺（色譜純），濃硫酸（分析純），均購自國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水；空白血清由揚州大學附屬淮安市婦幼保健院檢驗科提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Bennetnach C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（75∶25，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：243 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL；液相色譜工作站：Ezchrom Elite。

2.2 溶液配制

取VPA對照品10.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為1mg/mL的VPA對照品貯備液；取4-ene-VPA對照品5.00mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得質量濃度為1 mg/mL的4-ene-VPA對照品貯備液；于-20℃冰箱中保存，備用。取環己甲酸4.00 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，混勻，即得質量濃度為40 mg/L的內標提取液；取2-溴代-4-硝基苯乙酮100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容，即得質量濃度為10 mg/mL的2-溴代-4-硝基苯乙酮溶液；于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 樣品處理

取患兒血清250μL，加入500μL乙腈，沉淀蛋白，加入250μL（1 mol/L）稀硫酸，渦旋1 min，加入內標提取液1 mL，渦旋2 min；以4000r/min的速率離心15 min，吸取上層有機相600μL置試管中，加入堿化液100μL、衍生化試劑50μL，混勻，于40℃超聲處理（功率為80W，頻率為40kHz）5 min，氮氣吹干。用100μL乙腈復溶，進樣。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：按2.3項下方法前處理樣品，按2.1項下色譜條件進樣測定。在此色譜條件下，VPA，4-ene-VPA與血清內源性物質均分離良好；4-ene-VPA、內標物質與VPA保留時間分別為7.93，10.55，17.88 min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取VPA對照品貯備液和4-ene-VPA對照品貯備液各適量，置試管中，40℃吹干，加入空白血清250μL復溶，配成VPA質量濃度分別為5，10，20，40，80，160，200μg/mL和4-ene-VPA質量濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，16.0μg/mL的系列標準血清樣品，各7份。按2.3項下方法操作，分別以VPA和4-ene-VPA的血藥濃度（X）為橫坐標、所測峰面積與內標物質峰面積之比（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程YV=0.004 7 XV-0.004 8，r=0.997 6（n=7）；Ye=0.018 5X e-0.008 3，r=0.997 8（n=7）。結果表明，VPA和4-ene-VPA血藥濃度分別在5～200μg/mL和0.5～16.0μg/mL范圍內與所測峰面積和內標物質峰面積比值的線性關系良好。

精密度試驗：按線性關系考察項下方法分別配制VPA高、中、低（100，40，10μg/mL）和4-ene-VPA高、中、低（8，4，1μg/mL）3種質量濃度的血清樣品，按2.3項下方法前處理，按2.1項下方法進樣測定，每日重復測定5次，共測定5 d，記錄血清中VPA和4-ene-VPA實測血藥濃度，計算日內、日間RSD。結果見表1。

表1 方法學考察結果（n=5）Tab.1 Results of the methodological investigation（n=5）

穩定性試驗：取精密度試驗項下3種質量濃度的VPA和4-ene-VPA血清樣品各5份，分別考察其在室溫放置12，24 h，反復凍融3次，-80℃冰凍放置15，30 d的穩定性。結果見表1，表明各質量濃度的血清樣品穩定性良好。

加樣回收試驗：按精密度試驗項下方法分別配制VPA高、中、低（100，40，10μg/mL）和4-ene-VPA高、中、低（8，4，1μg/mL）3種質量濃度的血清樣品，按2.3項下方法前處理，按2.1項下色譜條件進樣測定，每個血藥濃度平行5份，按公式[相對回收率（%）=實測血藥濃度/理論血藥濃度×100%]計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=5）Tab.2 Results of the recovery test（n=5）

2.5 癲癇患兒血藥濃度測定

采用HPLC法測定12例癲癇患兒血清中VPA和4-ene-VPA的血藥濃度。VPA治療5 d后，于晨起服藥前采集靜脈血1～2 mL，取血清，按2.3項下方法前處理。結果見表3。可見，2例合并托吡酯患兒血清中4-ene-VPA血藥濃度明顯降低，與張玲敏等[2]的研究結果類似，但本研究中選取病例數較少，目前無法形成具體結論，還需進一步研究。

表3 12例癲癇患兒血藥濃度測定結果Tab.3 Results of the determination of blood concentration in 12 children with epilepsy

3 討論

聯合用藥可能會干擾VPA和4-ene-VPA血藥濃度的測定結果，本試驗中考察了臨床可能聯用的藥物，如苯巴比妥、苯妥英鈉、地西泮、卡馬西平、拉莫三嗪、左乙拉西坦等對測定結果的影響。結果，上述藥物在該色譜條件下均對目標峰無干擾。

前期研究發現，乙腈作為蛋白沉淀劑不僅能有效沉淀蛋白，還能減弱加入內標提取液后引起的乳化現象，縮短血樣處理時間。乙腈同樣適用于測定血清中4-ene-VPA的血藥濃度[14]，在復溶過程中，乙腈具有較好的溶解性能，尤其是檢測低血藥濃度4-ene-VPA時。

VPA與4-ene-VPA分子結構相似，均無特征性的紫外吸收基團。故適宜的衍生化反應條件是準確測定VPA及4-ene-VPA血藥濃度的關鍵。目前，應用較多的衍生化反應條件為70℃條件下水浴反應15 min。但水浴溫度過高，可能會導致水蒸氣進入反應液，影響衍生化反應進行。另外，在水浴反應過程中，三乙胺的揮發也會在一定程度上影響反應進行，導致衍生化反應不完全。本研究中創新性地采用超聲法進行衍生化反應，與水浴加熱相比具有反應快、反應完全等優點[15]。