中藥復方止癬乳膏的提取及制備工藝優(yōu)選*

趙 瑩，翟 明，李苑華，張聲源，江中洪

（1.嘉應(yīng)學院，廣東 梅州 514031； 2.廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州514031； 3.嘉應(yīng)學院醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣東 梅州 514031）

中醫(yī)學認為，手足癬由外感濕熱、毒蟲沾染引起，日久郁阻皮膚脈絡(luò)，造成血不榮膚，治療多選用殺蟲、祛濕、清熱、祛風、活血之劑[1]。本課題組的前期研究中結(jié)合中醫(yī)學理論基礎(chǔ)，選用具有殺蟲、祛濕、清熱、祛風、活血等功效的皂角、荊芥、紅花及白礬4味中藥組方[2-4]，篩選其對具有抗真菌和抗炎作用的有效成分[5-6]，以槲皮素和總黃酮為指標成分，優(yōu)化提取方法。目前，市場上的抗足癬軟膏多為化學抗菌藥物[7-8]，抗足癬類中藥仍以洗劑為主[9-10]，而洗劑不易攜帶，藥液難以附著于皮膚，起效較慢。本研究中在對提取工藝進行優(yōu)化后，擬開發(fā)一種復方中藥抗足癬軟膏，通過正交設(shè)計優(yōu)化其制備工藝，并考察制劑的穩(wěn)定性，為復方中藥止癬乳膏的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；MING-CHE 24UV型超純水機（法國Merck Millipore公司）；TDZ5-WS型臺式離心機（長沙湘銳離心機有限公司）；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）；BSA1245型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為萬分之一）；JP-060型超聲波清洗機（深圳市潔盟設(shè)備有限公司，功率為240W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所，批號為C15H1007，純度≥98%）；蘆丁對照品（奧科生物科技研究所，批號為BWB51607，純度≥98%）；其他試劑均為分析純；皂角藥材（批號為20180115），荊芥藥材（批號為20180926），均購于宿遷圣軒閣有限公司；紅花藥材（批號為20180709），白礬藥材（批號為20170813），均購于大參林藥業(yè)股份有限公司。上述中藥材均經(jīng)嘉應(yīng)學院醫(yī)學院張聲源中藥學副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 復方中藥處方

取皂角、荊芥、紅花、白礬藥材各3 g，按1∶15（m/V）料液比進行配制。

2.1.2 提取方法考察[11-12]

水提法：1）水煎煮法。按1∶15（m/V）料液比加水，提取2次，合并提取液，濾紙過濾，密封備用。2）水超聲法。按1∶15（m/V）料液比加水，超聲提取（功率為240 W，溫度為50℃）1.5 h，提取液用濾紙過濾，密封，備用。

酸提法：1）酸浸提法。冰乙酸浸漬提取24 h，提取液用濾紙過濾，密封，備用。2）酸超聲法。提取條件與水超聲法相同，提取溶劑換為冰乙酸。

醇提法：醇浸提法與醇超聲法的反應(yīng)條件分別同酸浸提法和酸超聲法一致，提取溶劑更換為70%乙醇。

2.1.3 總黃酮提取率考察

蘆丁對照品溶液制備：稱取蘆丁對照品9.4 mg，精密稱定，置100 mL燒杯中，以60%乙醇溶液溶解，吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.188 mg/mL的對照品溶液，備用。

蘆丁線性關(guān)系考察：分別精密吸取蘆丁對照品溶液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL，置10 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加4%NaOH溶液4 mL，再用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，顯色[13]，于510 nm波長處測定吸光度。得回歸方程Y=0.220 8 X+0.006 8，R2=0.999 5（n=6），表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.5～5.0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

總黃酮提取率測定：按2.1.2項下提取工藝進行提取，過濾，取提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得供試品溶液。精密吸取供試品提取液1 mL，置100 mL容量瓶中，按標準曲線項下方法測定吸光度[13]。按公式1）計算總黃酮提取率（X）。結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取方法的總黃酮提取率比較Fig.1 Comparison of extraction rates of total flavonoid by different extraction methods

式中，X為總黃酮或槲皮素的提取率（%）；C為根據(jù)標準曲線計算的總黃酮或槲皮素質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為藥材提取液總體積（mL）；P為稀釋倍數(shù)；W為藥材質(zhì)量（mg）。

由圖1可知，超聲醇提法的總黃酮提取率最高為60.16%。水提取和醇提取過程中，超聲法的提取率高于煎煮法或浸漬法；酸提取過程中，浸提法高于超聲法。

2.1.4 槲皮素提取率考察

槲皮素對照品溶液制備：取槲皮素對照品1.5 mg，精密稱定，于燒杯中溶解，潤洗2～3次，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為15μg/mL的對照品溶液，備用。

槲皮素線性關(guān)系考察：分別精密吸取槲皮素對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，置25 mL容量瓶中，以蒸餾水為空白參比，于382 nm波長處測定吸 光 度。得 回 歸 方 程Y=0.341 9X-0.002 1，R2=0.9992（n=8），表明槲皮素質(zhì)量濃度在0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

槲皮素提取率測定：按2.1.2項下提取工藝進行提取，過濾，取提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得供試品溶液。精密吸取總黃酮提取率測定項下供試品提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，按公式1）計算槲皮素提取率（X）。結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取方法的槲皮素提取率比較Fig.2 Comparison of extraction rates of quercetin by different extraction methods

由圖2可知，以水和醇作為提取溶劑時槲皮素的提取率高于以酸為提取溶劑，且超聲法高于煎煮法或浸提法。分析原因，相較于浸提法及煎煮法，超聲法的溫度和超聲微波作用可提高提取率，從而增加槲皮素在提取溶劑中的溶解度，則槲皮素的浸出量相對較多。結(jié)合總黃酮提取率，則槲皮素的提取率為0.07%。

2.1.5 最佳提取工藝確定

綜合總黃酮和槲皮素的提取率考察結(jié)果，最終確定該復方最佳提取工藝為70%乙醇超聲提取，功率為240 W，溫度為50℃，提取1.5 h。

2.2 槲皮素與總黃酮含量測定方法學考察

精密度試驗：精密吸取槲皮素、總黃酮對照品溶液各0.2 mL，按標準曲線項下方法測定吸光度，重復測定6次。結(jié)果槲皮素、總黃酮吸光度的RSD分別為0.21%和1.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取復方中藥材粉末，各3 g，精密稱定，按上述最佳提取工藝提取，共制備供試品溶液12份，按標準曲線項下方法測定吸光度。結(jié)果槲皮素、總黃酮吸光度的RSD分別為0.26%和1.75%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取復方中藥材粉末，各3 g，精密稱定，按上述最佳提取工藝提取，過濾提取液，精密吸取提取液0.2 mL，于室溫下放置0，1，3，5，7，9，12，24 h時按標準曲線項下方法測定吸光度。結(jié)果槲皮素、總黃酮吸光度的RSD分別為0.33%和1.52%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.3 制備工藝研究

2.3.1 處方及制備

乳膏處方見表1。制備步驟為，按處方量稱取A，C兩相中各原料作為水相，稱取處方量B相中各原料作為油相，置（80±2）℃恒溫水浴箱中，攪拌，混勻，待油、水兩相完全溶解后，用溫度計測量溫度至（80±2）℃后，把油相（B相）倒入水相（A，C相）中，用玻璃棒在水浴鍋中往同一方向緩慢攪拌15 min，移出，室溫下繼續(xù)攪拌至冷凝。

表1 復方中藥乳膏基質(zhì)組分Tab.1 Matrix components of TCM compound cream

2.3.2 乳膏評分標準

總分100分，其中外觀質(zhì)量、pH、離心穩(wěn)定性及耐熱、耐寒穩(wěn)定性各20分。具體評分標準見表2。

表2 乳膏評分標準Tab.2 Scoring criteria of cream

2.3.3 制備工藝優(yōu)選

以十二烷基硫酸鈉（因素A）和單硬脂酸甘油酯（因素B）的含量、乳化溫度（因素C）、乳化時間（因素D）為考察因素，設(shè)計正交試驗因素水平表（見表3）。以綜合評分為評價指標，采用L9（34）正交試驗設(shè)計制備工藝（見表4），并采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件分析。正交試驗方差分析結(jié)果見表5。

表3 正交試驗因素水平表Tab.3 The factor levels of the orthogonal test

由表4可知，各因素對結(jié)果影響大小的順序為D＞C＞A＞B，且最優(yōu)處方為A3B2C2D1，即十二烷基硫酸鈉含量為1.5%，單硬脂酸甘油酯含量為4.0%，乳化溫度為80℃，乳化時間為15 min。由表5可知，各因素對結(jié)果均有顯著影響。故最終確定此條件為最優(yōu)制備工藝。

表4 L 9（34）正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果Tab.4 Design scheme and results of the L 9（34）orthogonal test

表5 L 9（34）正交試驗方差分析結(jié)果Tab.5 ANOVA results of the L 9（34）orthogonal test

3 討論

本研究中選取皂角中具有抑菌作用的主要成分槲皮素，以及4味中藥中均含有的抗炎成分總黃酮[14-17]的提取率作為考察指標，建立其紫外分光光度測定方法，篩選提取條件。

分別選擇了煎煮、浸漬、超聲、加熱回流4種提取方法[18]，經(jīng)過含量測定發(fā)現(xiàn)，加熱回流提取法的提取液中槲皮素和總黃酮的響應(yīng)值均較低，原因可能為加熱回流提取過程中藥材的結(jié)構(gòu)被破壞，有效成分含量降低，故最終選擇煎煮、浸漬和超聲3種提取方法進行研究。由圖1和圖2可知，超聲水提法和超聲醇提法的總黃酮和槲皮素提取率均較高，其中超聲醇提法總黃酮提取率最高，可能是由于超聲的空化作用、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速復方中藥材胞內(nèi)有效物質(zhì)釋放、擴散和溶解，提高了復方中藥的提取率。樣品中總黃酮含量遠高于槲皮素含量，故最終確定最優(yōu)提取工藝為超聲醇提法。

溫度對油、水兩相的融合、乳化有重要影響。溫度過低導致乳化不完全；溫度過高導致水分散失，使乳膏基質(zhì)失水變稠。乳膏制備工藝的單因素考察結(jié)果顯示，70℃和90℃溫度下乳膏的基質(zhì)得分較低。70℃時離心試驗和耐熱試驗均出現(xiàn)油水分離現(xiàn)象，原因可能為溫度較低時油、水兩相乳化不充分；90℃時，水分揮發(fā)過快，乳膏基質(zhì)變稠、質(zhì)地變硬、有顆粒感。故選擇75，80，85℃進行正交試驗。且乳化時間過短會導致油、水兩相乳化不完全，造成基質(zhì)穩(wěn)定性差，耐熱、離心試驗均會出現(xiàn)油、水分離現(xiàn)象。故選擇15，20，25 min乳化時間進行正交試驗。

制備工藝優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，以十二烷基硫酸鈉為乳化劑，制得的水包油（O/W）型乳膏易于涂抹、清洗，使用方便。基質(zhì)篩選時發(fā)現(xiàn)，在該處方中，不需將白凡士林與羊毛脂合用，單用白凡士林已有較好的吸水性，且制得的乳膏顏色潔白，耐寒、耐熱，pH穩(wěn)定在6.9～7.0，質(zhì)地、均勻度、涂展性均良好，皮膚潤滑度適中，不油膩，易清洗，久置不易變質(zhì)。藥物的加入方式考察中，對比了主藥提取液的2種不同加入方法。一是將主藥提取液與水相混合，提取液作為水相中的一部分，水浴加熱后與油相在相同溫度下混合；二是先將水相與油相在水浴中混合均勻，再加入主藥提取液。2種方法所制得乳膏的外觀、穩(wěn)定性及載藥量差異均不大，表明藥物的加入方式不是制備中藥復方止癬乳膏的主要影響因素。