抗白細胞介素6受體的活性成分虛擬篩選及其核心中藥干預新冠肺炎的網絡藥理學機制探討

吳 堅，張錫洪，徐文堅

（1.廣東省汕頭市中心醫院，廣東 汕頭 515031； 2.廣東省中山市小欖人民醫院，廣東 中山 528400）

發熱、乏力、干咳等癥狀是新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）感染初期的臨床表現，重癥患者可出現呼吸困難與低氧血癥，甚至發展為急性呼吸窘迫綜合征等[1]。目前尚無特效藥物及疫苗，臨床針對嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染患者的治療，多數沿用既往冠狀病毒感染的臨床治療經驗[2]。炎性風暴由于機體的免疫系統應答過于強烈，大量釋放細胞因子對肺組織造成損傷，是致使患者病情惡化甚至死亡的重要原因[3]。COVID-19患者由于后期機體產生炎性風暴導致多器官衰竭而死亡。參考文獻[4]分析了COVID-19患者的特征，發現患者特別是重癥患者的淋巴細胞計數均顯著降低，炎性因子白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）等水平均顯著升高。IL-6是與炎性反應關系最密切的炎性因子，常在急慢性炎性部位產生，通過與IL-6受體（IL-6R）結合誘導轉錄炎性應答，刺激更多細胞因子產生，參與炎性風暴[5]。IL-6/IL-6R的結合效應引發蛋白酪氨酸激酶（JAK）、信號傳導與轉錄激活因子（STAT3）、白細胞介素17A（IL-17A）、磷脂酰肌醇3-激酶-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、轉錄因子-κB（NF-κB）、Toll樣受體（TLR）等下游信號級聯反應[6-7]，其信號通路的激活會刺激IL-6靶向應答基因的表達，在信息傳導、細胞增殖、分化、免疫調節、炎癥、血管生成、腫瘤的發生和轉移中起重要作用。此外，低氧誘導因子1α（HIF-1α）信號通路靶向調控B細胞分泌IL-6，影響T細胞分化[8]。該過程參與免疫調控，和機體的炎癥密切相關。IL-6可誘導免疫細胞分泌血管內皮生長因子（VEGF），VEGF可提高血管的通透性，促使炎性細胞滲出[9]。血管形成和炎性反應是2個相互依賴的過程。上述因子間相互調節，形成一個復雜的網絡，促進組織炎癥的發生和發展。目前，我國發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[10]已明確將IL-6水平上升作為病情惡化的臨床警示指標，采用糖皮質激素作為免疫抑制劑治療炎性風暴，用于遏制重癥患者的免疫激化反應，但糖皮質激素的使用可能會降低機體抗病毒的能力，造成二次感染、病程延長及骨質疏松、股骨頭壞死等不良預后，且存在嚴重后遺癥風險，嚴重影響患者的生活質量[11]。

我國中醫藥在治療SARS-CoV-2感染、COVID-19患者中發揮了重大作用。中藥“多成分-多靶點-多效應”的整體治療特點使其在疾病防治方面具備獨特的優勢和潛力。中藥成分復雜，中藥單體作為中藥發揮療效的物質基礎，挖掘和篩選中藥單體具有重要意義。目前尚缺乏抗COVID-19炎性風暴相關機制研究的文獻報道，且尚未系統闡明中藥各組分及其治病機理。隨著各種高通量多組學技術的迅速發展，網絡藥理學及分子對接技術為探索中藥的科學依據提供了新策略[12]。網絡藥理學在系統藥理學和生物信息學及計算機技術的基礎上通過計算、分析與預測的研究方式將中藥及其成分和疾病生物網絡聯系起來，以期挖掘和發現藥效物質及其潛在的治病機制[13]。分子對接技術通過化學計量學方法模擬受體和配體間的相互作用，準確預測兩者結合的可能性，還可根據兩者的結合情況優化受體和配體的結構，為藥物篩選及設計提供新思路[14]。本研究中針對臨床報道的與炎性風暴最密切的IL-6R，利用分子對接技術對中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）中的天然小分子進行高通量挖掘，虛擬篩選出IL-6R的天然小分子抑制劑，并通過網絡藥理學預測富集IL-6R天然小分子抑制劑最多的核心中藥干預COVID-19的作用機制，為新藥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 小分子數據庫的建立

基于TCMSP數據庫，納入2015年版《中國藥典（一部）》收錄的499種中藥及其含有IL-6R天然小分子抑制劑的化合物共13 143個，下載化合物的MOL2格式3D結構的文件，建立分子對接技術虛擬篩選的小分子數據庫。

1.2 基于ADME和Lipinski規則的評估

基于ADME參數[15]即口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，以及Lipinski規則[16]即相對分子質量（MW）＜500、脂水分配系數（clogP）＜5、氫鍵給體數目（Hdon）＜5，對小分子抑制劑數據庫的活性成分進行初步篩選，篩選藥動學性質和OB良好的化合物，以減少陰性結果出現的概率，從結構和性質角度過濾成藥性較低的化合物，以提高篩選效率。

1.3 分子對接

在RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）網站中下載IL-6R（1N26）的3D結構文件，通過Raccoon軟件對小分子進行加氫、加電荷、移除非極性氫、刪除孤對電子，以及建立特殊可旋轉鍵等批量預處理。采用Discovery studio 2.5軟件將1N26中的配體/底物清除，并獲得IL-6R。據報道，Phe229 and Phe279兩個氨基酸殘基不僅是IL-6R的關鍵結合位點[17-19]，也是目前IL-6R的研究熱點。因此，以Phe229和Phe279兩個氨基酸殘基在IL-6R中的位置設置用于本研究中分子對接的結合口袋。運用Autodock Vina和Python腳本完成高通量分子對接，根據每個化合物的最優結合能進行排序，若結合能小于0，則說明配體和受體可自發結合，目前分子對接結果的篩選尚無統一標準，以結合能≤-20.92 kJ/mol作為對接依據[19]，為提高結果的可靠性，以結合能≤-25.10kJ/mol作為篩選潛在活性成分的對接依據。

1.4 成分靶點預測及其抗COVID-19靶點確認

將核心中藥的潛在活性成分導入TCMSP數據庫中，獲得成分對應的靶點，將潛在靶點進一步映射到Uniprot（http://www.uniprot.org/）數據庫，并轉換為官方名稱（gene symbol）。檢索OMIM和GeneCard數據庫有關COVID-19的相關靶點，將成分靶點和疾病靶點輸入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線服務器中，獲得兩者的交集部分，即為核心中藥干預COVID-19發生、發展的潛在靶點，并將這些靶點導入String數據庫中獲得蛋白質相互作用（PPI）網絡。

1.5 GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析

將預測核心中藥對有效成分的潛在靶點提交到生物信息學數據庫DAVID 6.8進行GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析，以預測核心中藥的分子機制。

1.6 成分-靶點-通路網絡構建

將核心中藥的活性成分、潛在靶點及相關通路信息導入Cytoscape 3.7.1軟件，以構建成分-靶點-通路網絡，闡釋其多效協同的作用特點。

2 結果

2.1 基于ADME和Lipinski規則的評估

13 143個化合物中，2 454個成分滿足要求，即OB≥30%且DL≥0.18。在符合ADME性質的基礎上，1 511個成分同時符合ADME和Lipinski規則的要求，共涉及372個中藥，提示上述成分具有良好的藥動學性質、OB及OL。

2.2 分子對接

2.2.1 與IL-6R對接結合能在不同區間的分析

初篩結果顯示，分子對接數據顯示結合能在（-25.10，0]kJ/mol區間的成分有624個，在（-29.29，-25.10]kJ/mol區間的成分有800個，在（-33.47，-29.29]kJ/mol區間的成分有86個，結合能小于-33.47 kJ/mol的成分僅1個，提示存在87個成分具有較強且穩定的結合結果，說明上述成分具有良好的開發潛能。其中，芝麻素（sesamin）與IL-6R的結合最好，提示該化合物具有良好的開發潛能，由于數據較多，因此本研究僅展示結合能小于-29.29 kJ/mol的結果。詳見表1。

2.2.2 成分和中藥分布情況

由表1可知，結合能小于-25.10 kJ/mol的成分共887個，通過TCMSP進行成分的中藥歸屬分析見圖1。6味清熱藥板藍根、白屈菜、苦地丁、苦參、赤芍、關黃柏，4味活血化瘀藥丹參、延胡索、沒藥、桃仁，3味止咳平喘藥百部、桑白皮、洋金花，3味補益藥甘草、枸杞子、靈芝，2味理氣溫理藥枳實、吳茱萸，化瘀止血藥降香，1味祛風濕散寒藥雷公藤。其中，甘草含有IL-6R天然小分子抑制劑成分最多，主要包括多糖類、黃酮類、三萜類等，提示甘草在干預COVID-19中發揮著重要作用。

圖1 活性成分整體富集15個及以上的中藥Fig.1 Traditional Chinese medicine with overall enrichment of 15 or more active components

結合能小于-25.10 kJ/mol的成分中，能富集10種中藥以上的成分有16個（見表2）。其中，木犀草素富集的中藥種類最多，為90種。說明木犀草素來源廣泛，且其與IL-6R也有較好的結合。16個化合物中，多數為黃酮類化合物，說明黃酮類化合物在天然藥物中廣泛存在，提示該類成分在抑制IL-6R活性上具有良好的開發潛能。

表2 整體成分富集10種中藥以上的成分Tab.2 Components with more than 10 traditional Chinese medicines enriched in overall components

由表1可知，與IL-6R的結合能小于-29.29kJ/mol的87個成分中，能富集4種中藥以上的成分有9個（見圖2）。其中，富集藥材數量排名前3的成分分別為MOL001458-黃連堿（9味中藥）、MOL001558-芝麻脂素（7味中藥）、MOL007180-維生素E（8味中藥），其中芝麻脂素與IL-6R的結合最強，來源廣泛。

圖2 篩選關鍵成分（能富集4種以上的中藥）的網絡Fig.2 Network for screening key components（capable of enriching more than four kinds of traditional Chinese medicines）

表1 與IL-6R對接結合能小于-29.29 k J/mol的成分Tab.1 Components with docking binding energy less than-29.29 k J/mol with IL-6R

包含4個及以上活性成分的中藥有7味（見圖3），包含成分數量排名前3的中藥分別為甘草（10個成分）、苦地丁（8個成分）、白屈菜（6個成分）。可見，甘草不僅是與IL-6R結合能小于-25.10kJ/mol化合物最多的中藥，還是與IL-6R結合能小于-29.29 kJ/mol化合物最多的中藥，提示甘草在抑制IL-6R中具有良好的潛在活性。

圖3 篩選核心中藥（包含活性成分不少于4個）的網絡Fig.3 Network for screening core traditional Chinese medicine（including no less than four active components）

2.3 甘草干預COVID-19的網絡藥理學機制分析

潛在靶點：甘草為治療COVID-19的核心中藥，共獲得82個甘草對應的靶點，259個COVID-19相關靶點，將兩者的靶點進行比對，獲得16個甘草干預COVID-19的潛在靶點。結果見圖4。

圖4 甘草治療COVID-19的潛在靶點Fig.4 Potential targets of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma against of COVID-19

KEGG通路富集分析：甘草干預COVID-19的通路可視化結果見圖5。圖中顯示了排名前20的信號通路，16個潛在靶點參與的信號通路主要與免疫與炎癥、癌癥、慢性疾病等密切相關，包括HIF-1 signalingpathway、VEGFsignaling pathway、血小板活化（Platelet activation）、Pathways in cancer、TNF signaling pathway等79條，P＜0.01的通路有63條。其中，HIF-1，VEGF，Platelet activation，TNF，PI3K-Akt，IL-17，TLR信 號 通 路 與COVID-19的發生、發展密切相關，提示甘草可能通過上述通路發揮抗COVID-19的作用。甘草干預COVID-19的GO生物功能注釋結果見圖6。結果顯示，16個靶點主要注釋了7個方面的生物功能，包括胸腺發育（thymus development）、花生四烯酸代謝過程（arachidonic acid metabolic process）、肌肉收縮的負調節（negative regulation of muscle contraction）、超氧化物代謝過程（superoxide metabolic process）、脂多糖類介導的信號通路（lipopolysacchiaride-mediated signalingpathway）、血管內皮細胞遷移的調節（regulation of blood vessel endothelial cell migration）、細胞氧化劑排毒（cellular oxidant detoxification），上述功能主要與免疫調節、炎性干預、氧化應激、抗凝與凝血系統調控等生物過程的發生、發展密切相關。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

圖6 GO生物功能注釋Fig.6 GO biological function annotation

潛在“成分-靶點-通路”網絡構建：為了闡釋甘草干預COVID-19生物網絡的復雜分子機制，本研究篩選通路中P值排名前20的通路，構建“成分-靶點-通路”網絡。結果見圖7。該網絡中共含有98個節點，其中有62個成分（紅色）、16個靶點（黃色）、20條通路（綠色），上述節點共構成了578條關系，其中靶點與成分之間存在400條關系，靶點與靶點之間存在65條關系，靶點與通路之間存在113條關系，提示甘草的作用靶點不僅在一定程度上相互影響，還分布于不同的通路上，充分體現了中藥治療疾病是“多成分-多靶點-多途徑”相互協調的共同結果。

圖7 甘草抗COVID-19的潛在“成分-靶點-通路”網絡Fig.7 Potential″component-target-pathway″network of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma against COVID-19

3 討論

COVID-19屬中醫“濕毒疫”范疇，主要表現為發熱、干咳、乏力、咽痛等。感染病毒后，機體在對抗病毒過程中產生大量氧自由基和炎性因子，破壞支氣管及肺泡中的上皮-內皮屏障，造成肺泡-毛細血管氧傳遞功能障礙和氧擴散能力受損，致使重癥COVID-19患者出現呼吸困難與低氧血癥，甚至產生嚴重的凝血功能障礙及形成血栓，易導致患者并發膿毒血癥及發展為急性呼吸窘迫綜合征，直至后期機體產生炎性風暴導致多器官衰竭乃至死亡。面對COVID-19發生與發展的復雜多變性，在中醫辨證施治的理論指導下，中藥的整體療效具有得天獨厚的優勢。為促進天然分子的高效開發與利用，探討中藥抗COVID-19的藥效物質基礎及其作用機制意義重大。故本研究中在多項研究的基礎上，運用分子對接技術高通量的虛擬篩選，獲得了符合ADMELipinski規則且與IL-6R結合較好的IL-6R天然小分子抑制劑887個，其中結合最強的是芝麻素。本研究中篩選獲得的IL-6R天然小分子抑制劑多數為黃酮類成分，其中來源最廣的為木犀草素；多數IL-6R天然小分子抑制劑集中在清熱類藥材中，其中含有最多潛在IL-6R天然小分子抑制劑的為甘草，可為IL-6R天然小分子抑制劑的開發提供候選化合物和理論依據。

芝麻素[20]和木犀草素[21]具有顯著的抗炎藥效，其主要作用機制是通過顯著降低環氧合酶2（COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）等活性，誘導產生炎性介質的限速酶的表達及IL-6，TNF-α等促炎因子的產生。芝麻素[22]和木犀草素[23]還有平衡氧化應激穩態的作用，其主要通過抑制活性氧（ROS）的產生和提高過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性，保護細胞免受氧化應激的損傷。此外，芝麻素[24]和木犀草素[25]還有顯著的抗高血壓、高血脂、高血糖（簡稱三高）作用及血管內皮保護功能，表明芝麻素和木犀草素具有潛在的保護心血管系統功能。近期研究表明，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、糖尿病患者是COVID-19的易感人群[26]，且三高疾病會加重COVID-19患者的病情。因此，面對并發心血管疾病的COVID-19患者，對其進行抗病毒、抗炎、增強免疫治療的同時，還應加強防范誘發或加重COVID-19患者病情的危險因素。

此外，本研究中從網絡藥理學的角度進一步探討了甘草抗COVID-19可能參與的生物過程與信號通路。KEGG通路富集和GO生物功能注釋分析結果表明，甘草參與治療COVID-19的16個潛在作用靶點主要富集在HIF-1，VEGF，Platelet activation，TNF，PI3K-Akt，IL-17，TLR等與肺癌、肺纖維化、肺炎、氣道炎癥、肺栓塞等肺部疾病密切相關的信號通路中，上述通路主要涉及免疫調節、炎性干預、氧化應激、抗凝與凝血系統調控等生物功能，提示甘草通過多通路協同發揮治療COVID-19的作用。

甘草具有潤肺止咳、補氣益腎、調和解毒、緩急止痛等功效，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、調節免疫等多種藥理學作用，國內外一直用甘草及其提取物治療咳嗽、支氣管炎、肺炎等呼吸系統疾病，主要通過抑制氧化應激和細胞凋亡，改善免疫功能而抑制炎性細胞因子表達、減輕肺纖維化形成和急性肺損傷等，以保護肺上皮細胞，改善肺功能，保護宿主；其物質基礎主要包括多糖類、黃酮類、三萜類等，尤其是甘草酸苷、甘草素、異甘草素、甘草酸二銨及甘草酸、甘草查爾酮A、光甘草定等成分[27]。有研究證實，甘草酸作為甘草中含量最高的有效成分，其化學結構與激素類似，具有類皮質激素作用，主要用于對抗病毒炎性風暴，兩者同為抗炎藥，最大的區別在于甘草酸無免疫抑制作用[28]。因此，甘草酸在抗炎的安全劑量范圍內既可抵抗炎性風暴，又不干擾機體對抗病毒的能力。復方甘草酸苷用于治療非典型肺炎的臨床效果確切，其主要成分甘草酸苷為甘草中的有效活性成分[29]，具有保護肝細胞膜、抗炎、抗病毒、調節免疫等藥理學作用，鑒于SARS-CoV-2與SARS-CoV有很多相似之處[30]，因此，考慮甘草酸苷用于治療SARS-CoV-2具有很大的借鑒意義。作為甘草主要活性成分之一的甘草酸二胺能明顯抑制普通型COVID-19患者的炎性反應，提高免疫功能[31]，且臨床療效顯著，安全性高。

甘草次酸具有抑制血小板聚集的作用，可能是通過抑制血小板活化因子生物合成的通路，除了通過抑制COX-2蛋白和mRNA表達外，還能抑制磷脂酶A2活性、血栓素A2合成、磷酸二酯酶升高，降低環磷酸腺苷水平等多個環節，實現抑制血小板聚集作用，阻斷血栓形成，進而防治肺栓塞的發生、發展[32]。異甘草素和甘草酸作為甘草的主要活性成分[33]，是一種凝血酶抑制劑，能延長血漿復鈣、凝血酶和纖維蛋白原凝塊時間，抑制凝血酶誘導血小板聚集，抑制血栓形成，上述過程主要受VEGF信號通路和Platelet activation通路調控。甘草及其有效成分具有降糖、調脂作用，可從源頭上防治糖尿病及其并發癥的發生和發展[34]。糖尿病并發癥信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）為調控糖尿病、糖尿病并發癥的重要信號通路[35]，甘草酸及其苷元甘草次酸可通過AGE-RAGE信號通路防治糖尿病腎病和糖尿病血管病變[36]。甘草單一成分的多靶點藥效和機制研究提示上述成分對甘草抗COVID-19藥效具有重要貢獻。

甘草有效成分對心、腦、血管、肝、腎、肺等各種臟器具有保護作用[37]，有助于防治糖尿病引起的各種并發癥，提示甘草有利于阻斷COVID-19炎性風暴對患者多器官的損傷。因此，甘草可在減輕炎癥對機體急性損傷的同時，面對危重患者的高凝狀態還有防治肺栓塞的潛在藥效，提示甘草不僅具有潛在的抗COVID-19炎性風暴作用，還能有效防治并發癥的發生、發展，這可能與甘草配伍其他中藥治療COVID-19患者起到協同增效、調和諸藥作用有關。目前，未見甘草及其主要活性成分抗COVID-19的潛在機制HIF-1，PI3K-Akt信號通路的相關報道，但可為甘草及其主要活性成分抗COVID-19的作用機制研究提供新的研究方向和思路，以及為抗COVID-19的新藥開發提供候選化合物及甘草抗COVID-19的物質基礎和作用機制的闡釋提供一定理論依據。

我國自主研發的“三方三藥”[38]在此次抗疫中起到了非常重要的作用，“三方三藥”中的“清肺排毒湯”“化濕敗毒方”“宣肺敗毒方”，以及連花清瘟顆粒/膠囊、血必凈注射液、金花清感顆粒6個中藥組方均含有甘草。從清肺排毒湯中共鑒定出了39種化學成分[39]，且檢測到其入血成分共12種，這些成分廣泛分布于血清、心、肝、脾、肺、腎中，包括甘草的甘草酸、甘草苷等主要成分；連花清瘟中鑒定出61種化學成分，且22種以原型入血，包括甘草的主要成分芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草苷、甘草素、甘草酸等[40]。對全國抗COVID-19方劑的組方規律的分析結果表明，甘草的使用頻次最高[41]。本研究結果與以上研究不謀而合，可為抗COVID-19方劑配伍甘草的原因提供更多參考。

本研究中以分子對接技術高通量虛擬篩選獲得了最具代表性的潛在抗IL-6R的天然小分子抑制劑如芝麻素和木犀草素等化合物，以及包含該類天然小分子抑制劑最多的中藥甘草。芝麻素和木犀草素除了具有抗IL-6R的潛在活性外，還具有抗炎、抗氧化、降血壓、調脂、降血糖等多種藥理作用，具備應對COVID-19復雜發生、發展的潛在能力。作為“國老”的甘草，不僅其多種化學成分具有潛在的抗IL-6R活性，其多種主要活性成分還具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓、調脂、降血糖、增強免疫力等廣泛的藥理學作用，且對多種器官具有保護作用。甘草通過多種途徑抵抗COVID-19對患者器官損傷的同時，還能防治重癥患者并發癥的發生、發展，充分體現了中藥“多成分-多靶點”作用機制的復雜性及其藥理學作用的多效性和廣泛性，說明了抗COVID-19方劑中配伍甘草入藥的原因。本研究中僅采用虛擬對接技術分析，具有一定局限性，還需進行試驗驗證。