三仁合劑治療濕熱型感冒的潛在物質(zhì)基礎和作用機制研究*

曾奇璐，蘇泰安，賀楨翔，趙靈麗，鄭榮蕾，劉 濤△

（1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 611756； 2.太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司，重慶 401336； 3.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106）

急性上呼吸道感染由細菌以外病原體引發(fā)，以病毒感染最常見[1]，病毒通過入侵鼻咽喉，破壞呼吸道上皮細胞，引起咽黏膜充血，伴有黏液性和漿液性炎性滲出等[2]。感冒屬中醫(yī)“溫病”“溫疫”“傷風”“傷寒”等范疇，其病機有六淫致病之說，《素問·至真要大論》載“夫百病之生也，皆生于風寒暑濕燥火”，提出外邪致病因素有風、寒、暑、濕、燥、火6種[3]；“六淫之邪無毒不犯人”，也可兼夾而生，常見有風寒、溫熱、暑濕等類型[4]。不同類型的感冒有相應的發(fā)生、傳變規(guī)律，中醫(yī)強調(diào)辨證論治。三仁合劑是根據(jù)溫病大家吳鞠通《溫病條辨》中三仁湯轉劑型而來，由苦杏仁、豆蔻、薏苡仁、滑石、淡竹葉、姜半夏、通草及厚樸組方。苦杏仁宣利上焦肺氣、氣行則濕化，豆蔻芳香化濕、行氣寬中、暢中焦之脾氣，薏苡仁甘淡性寒、滲濕利水而健脾、濕熱從下焦而去，三仁合用，三焦分消，為君藥；滑石、通草、竹葉甘寒淡滲，加強君藥利濕清熱之功效，為臣藥；半夏、厚樸行氣化濕，散結除滿，為佐藥。全方具有宣化暢中、清熱利濕功效。現(xiàn)代研究表明，水通道蛋白（AQPs）的異常表達可能是濕熱證的發(fā)生機制之一[5]，三仁湯可能影響AQPs在機體中的表達，從而防治呼吸系統(tǒng)疾病。賴鵬華等[6]發(fā)現(xiàn)，三仁湯可能通過促進肺組織AQP5表達，導致MUC5AC分泌抑制，阻止?jié)駸岘h(huán)境下呼吸系統(tǒng)疾病的氣道黏液高分泌狀態(tài)持續(xù)發(fā)展。三仁湯能較好地調(diào)節(jié)濕熱證、濕偏重證大鼠機體中AQP2和AQP3的表達，對炎性損傷有修復作用，有助于恢復體內(nèi)水液代謝平衡[7-8]。三仁湯有助于上呼吸道感染等外感疾病的治療[9-10]。網(wǎng)絡藥理學是系統(tǒng)生物學的組成部分，其整體觀與系統(tǒng)性同中醫(yī)藥的配方組合、辨證論治原則相符合，運用網(wǎng)絡藥理學挖掘中藥化學成分與相關靶標有助于從分子網(wǎng)絡水平闡釋中藥的作用機制和藥效物質(zhì)基礎，也有助于多靶點藥物的開發(fā)和老藥新用的發(fā)現(xiàn)[11-13]。分子對接是指通過電腦模擬將小分子（配體）放置于大分子靶標（受體）的結合區(qū)域，再通過計算物理化學參數(shù)，從而達到預測兩者的結合力（結合親和性）和結合方式（構象）的一種理論模擬方法[14]。本研究中以臨床應用為依據(jù)，通過網(wǎng)絡藥理學與分子對接技術探求藥物發(fā)揮藥效的作用機制，為臨床合理應用三仁合劑提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 三仁合劑中活性成分及靶蛋白的虛擬篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP[15]（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“苦杏仁”“豆蔻”“薏苡仁”“滑石”“淡竹葉”“姜半夏”“通草”“厚樸”為關鍵詞，檢索其化學成分信息。口服生物利用度（OB）是指制劑中藥物被吸收后進入人體循環(huán)的速度與程度，反映所給藥物進入人體循環(huán)的藥量比例，是評價藥物能否發(fā)揮藥效的重要指標[16]，可反映藥物的生物活性分子的類藥性（DL）。DL值是化學成分在機體中產(chǎn)生活性的重要參數(shù)[17]。考慮三仁合劑為口服的給藥形式，設定OB≥30%且DL≥0.18，檢索出其活性成分，并在“Related Targets”功能中預測獲得相應化學成分靶蛋白。將受體名稱上傳至Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），限定物種為“Human”，轉換得到UniprotID及受體-基因名。

1.2 疾病基因獲取及韋恩圖構建

從GeneCards數(shù) 據(jù) 庫（https://www.genecards.org/）中獲取疾病相關基因，選擇得分排名前300的基因作為該疾病的靶基因。將上述“成分-靶點”“疾病-靶點”導入Venny 2.1.0網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲得交集基因。

1.3 靶標通路富集分析及繪圖

將上述交集基因導入DAVID數(shù)據(jù)庫[18]（https://david.ncifcrf.gov/），設定物種為“Homo sapiens”，點擊Clear all，分別選擇Gen Ontology中的GOTERM BPDIRECT，GOTERM CC DIRECT，GOTERM MF DIRECT和Pathways中的KEGG PATHWAY，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并獲得分析結果。將termdescription和observed gene count分別作為縱、橫坐標繪圖，GO功能富集分析結果用GraphPad Prism 6.0繪圖軟件繪制柱狀圖；KEGG通路分析結果用Omicshare數(shù)據(jù) 庫（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）繪制高級氣泡圖。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡與成分-靶點通路的構建

將不重復的基因導入String數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/cgi/input.pl），選擇物種為“Homosapiens”，獲得蛋白相互作用關系網(wǎng)絡。將成分、靶點導入Cytoscape Version 3.7.0軟件，構建“成分-靶點”網(wǎng)絡。以大于2倍度中心性（degree）的中位數(shù)為標準，通過網(wǎng)絡拓撲參數(shù)篩選關鍵節(jié)點，預測三仁合劑治療濕熱型上呼吸道感染活性化合物的潛在物質(zhì)基礎。

1.5 成分-靶點分子對接

通過RSCB數(shù)據(jù)庫[19]（https://www.rcsb.org/）下載得到腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）及（Flu A）M2，（Flu A）HA靶標蛋白，以pdb格式保存其3D結構，使用Discovery Studio軟件去除靶蛋白配體和水分子等非蛋白分子。通過PubChem數(shù) 據(jù) 庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得baicalein，luteolin，quercetin化合物結構的sdf格式文件。通過ZINC數(shù)據(jù)庫（http://zinc15.docking.org/）獲得藥物化合物的sdf格式文件。將去水加氫后的蛋白質(zhì)及化合物上傳至PyRx軟件，剛性化蛋白質(zhì)分子，再上傳化合物，使其能量最小化，更改文件格式為pdbqt，最后運用vina進行對接。以結合能≤-5.0 kJ/mol為標準篩選能與靶標蛋白自發(fā)結合的藥物活性分子[20-21]。

2 結果

2.1 三仁合劑活性成分

共得到三仁合劑的活性成分52個，其中苦杏仁19個，豆蔻12個，薏苡仁5個，姜半夏11個，通草3個，厚樸2個，數(shù)據(jù)庫中均未查到滑石、淡竹葉的化學成分。詳見表1。

表1 三仁合劑中52個活性成分的基本信息Tab.1 The basic information of 52 active components in Sanren Mixture

2.2 成分-靶點網(wǎng)絡構建

將52個活性成分導入TCMSP數(shù)據(jù)庫，共獲得775個靶點，通過Uniprot校正后得到229個不重復的基因。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得疾病相關基因1 191個，選擇相關性較高的前300個基因作為疾病基因，以Venn 2.1.0為工具取得交集基因62個。詳見圖1。

圖1 交集基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of intersection genes

通過Cytoscape 3.7.0構建了成分-靶點網(wǎng)絡，共38個節(jié)點，171條邊。詳見圖2。其中紅色為化合物成分，綠色為作用靶點，紅邊代表靶點間的作用關系，藍邊代表化合物與靶點間的作用關系。Degree是在網(wǎng)絡分析中刻畫節(jié)點中心性（Centrality）最直接的度量指標。通過Degree排序可確定關鍵節(jié)點，Degree越大在整個網(wǎng)絡中的樞紐性越強[22]，Degree≥2倍中位數(shù)（中位數(shù)成分=1.5，中位數(shù)靶標=7）的成分分別為MOL000098-槲皮素（quercetin）、MOL000006-木 犀 草 素 （luteolin）、MOL002714-黃芩素（baicalein）。其中，槲皮素、木犀草素來源于君藥豆蔻，黃芩素來源于半夏。靶標有TNF-α，IL-6，VEGF-A，均為炎癥有關靶標[23-25]。

圖2 三仁合劑成分-靶點網(wǎng)絡Fig.2 Components-targets network of Sanren Mixture

2.3 通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫中，GO功能富集分析得到GO條目1 555個，其中生物過程（BP）條目1 347個，細胞組成（CC）條目73個，分子功能（MF）條目135個。詳見圖3。選擇KEGG通路富集分析結果的前20條繪制高級氣泡圖，主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、致 癌 通 路（Pathways in cancer）、瘧疾（Malaria）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等。詳見圖4。

圖3 三仁合劑靶標的GO功能富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of the targets of Sanren Mixture

圖4 三仁合劑作用靶點KEGG通路富集分析的20條通路Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of 20 pathways of targets of Sanren Mixture

2.4 分子對接結果

將三仁合劑中的關鍵成分、抗病毒西藥與抗炎抗病毒相關受體對接，關鍵化合物中黃芩素與VEGF-A受體、（Flu A）M2、（Flu A）HA的結合能最低，分別為-26.36，-36.40，-38.91 kJ/mol；木犀草素與TNF-α的結合能最低，為-37.24 kJ/mol；槲皮素與IL-6的結合能最低，為-28.03 kJ/mol。藥物配體與蛋白受體的結合能越低，越容易結合。結果見圖5和表2。

表2 三仁合劑中核心化合物及臨床治療藥物與疾病相關靶點的結合親和力Tab.2 The binding affinity of the core compounds in Sanren Mixture and clinical therapeutic drugs with disease-related targets

圖5 疾病相關靶點與槲皮素、木犀草素及黃芩素的分子對接模式Fig.5 Molecular docking patterns of disease-related targets with quercetin，luteolin and baicalein

3 討論

急性上呼吸道感染多由病毒引起，占門急診患者的1/3以上。突發(fā)性傳染病嚴重急性呼吸綜合征（SARS）、甲型流感（H1N1）及嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV-2）均從口鼻而入，首襲犯肺，與中醫(yī)學理論描述的溫病疫毒傳播方式相似，被歸為“濕疫”[18-20]。中醫(yī)認為，呼吸道感染與濕熱有相關性。葉天士認為，“肺位最高，邪必先傷”“溫邪上受，首先犯肺”，其病機關鍵在于濕毒疫邪侵襲犯肺、損其脾胃。薛生白《濕熱篇》中提到：“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱。”提示濕熱證來源于脾胃受損，致使外濕不散、內(nèi)濕不運，加上疫毒病氣侵襲，內(nèi)外牽引。三仁合劑具有宣上、暢中、滲下之效，有助于脾胃運化、宣降肺氣、祛濕透邪。

網(wǎng)絡藥理學研究中，TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄三仁合劑方中礦物藥滑石和植物藥淡竹葉成分。滑石的成分主要為含水硅酸鎂，有導熱下行之效[26]。因此，將含水硅酸鎂與TNF-α，IL-6，VEGF-A，（Flu A）M2，（Flu A）HA靶點分別進行分子對接，結果顯示，同其余化合物成分相比，與靶點的結合能力較弱，將其納入三仁合劑發(fā)揮藥效的潛在重要化合物，后期將進一步研究。淡竹葉可清熱、除煩、利尿，從多個部位提取分離得黃酮類、多糖類、蘆竹素、白茅素、無羈萜、豆甾醇等成分，但對其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎的研究鮮有報道[27]。由于TCMSP數(shù)據(jù)庫收載不完整，且各數(shù)據(jù)庫間篩選標準及算法不一致，故未將滑石、淡竹葉納入三仁合劑治療濕熱型感冒的核心活性化合物。

由網(wǎng)絡藥理學分析結果可知，排前3名的核心化合物（槲皮素、木犀草素、黃芩素）均為黃酮類成分。通過整理分子對接機制結果，參與分子對接結合的槲皮素、木犀草素、黃芩素3種化合物均為能與靶標蛋白自發(fā)性結合的藥物活性物質(zhì)，其中黃芩素與VEGF-A受體、（Flu A）M2、（Flu A）HA的結合能最低，木犀草素與TNF-α的結合能最低，槲皮素與IL-6的結合能最低。與臨床推薦使用的急性上呼吸道感染藥物利巴韋林、奧司他韋相比，這些成分與TNF-α，IL-6，VEGF-A，（Flu A）M2，（Flu A）HA靶點的結合能更低，更易結合。通過分子對接2D圖可知，藥物關鍵成分通過范德華力、傳統(tǒng)氫鍵和π-π堆積等鍵力作用與抗炎、抗病毒相關靶點結合，一些氨基酸殘基可能成為藥物成分與其發(fā)揮作用的活性位點。隨著中醫(yī)在治療呼吸道疾病中應用的逐漸擴大，不斷挖掘治療急性上呼吸道感染活性化合物的潛在物質(zhì)基礎，探討潛在活性化合物與治療靶點的作用內(nèi)涵，有利于更系統(tǒng)、全面地揭示中藥活性成分發(fā)揮藥效的潛在分子機制，以及應對病毒多樣化、復雜化的趨向。

綜上所述，結合臨床應用，通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，發(fā)現(xiàn)了三仁合劑發(fā)揮藥效的潛在活性化合物槲皮素、木犀草素、黃芩素，以及治療濕熱型感冒的作用機制。鑒于網(wǎng)絡藥理學存在數(shù)據(jù)庫采集信息不全面、未考慮實際化合物含量等問題，分析結果具有一定局限性。