640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞增殖的時間劑量依賴性效應(yīng)及對TGF-β相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

易 斌 郭慶霞 何 軍 韓克影 凡靜靜

1.北京創(chuàng)盈光電醫(yī)療科技有限公司，北京 100176；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206

妊娠紋是由于孕期腹部隆起后皮膚出現(xiàn)的波浪狀花紋，分娩后花紋逐漸消失形成有光澤的瘢痕線紋，即妊娠紋[1]。妊娠紋嚴(yán)重影響女性的皮膚美觀，因此受到社會廣泛的關(guān)注。妊娠紋的治療主要包括藥物治療、激光治療、微創(chuàng)手術(shù)治療、紅光治療等[2-3]，但是目前無明確的治療方法。妊娠紋產(chǎn)生的機制涉及內(nèi)分泌調(diào)控、遺傳基因易感性以及表皮細(xì)胞的增殖等[4-5]，但是最終的調(diào)控核心是皮膚中膠原纖維和彈力纖維的減少及斷裂[6-7]。皮膚被拉伸形成妊娠紋的過程中，拉伸力使成纖維細(xì)胞收縮衍變成肌纖維母細(xì)胞[8]。妊娠紋的肌纖維母細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，不能合成膠原蛋白和彈性蛋白[9-10]。因此妊娠紋的治療主要調(diào)控成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原纖維和彈性纖維的表達(dá)。紅色光波一般介于600～700 nm，紅光治療主要依賴光化學(xué)作用，而不是能量作用[3]。目前紅光治療主要應(yīng)用于消炎、加速組織修復(fù)、促進(jìn)骨折愈合、淡化瘢痕等領(lǐng)域[11-12]。640 nm主要應(yīng)用于皮膚治療領(lǐng)域。妊娠紋是皮膚損傷后留下的痕跡[13]，而640 nm紅光治療妊娠紋的作用機制不明確。本研究將采用不同強度（時間）的640 nm紅光照射人真皮成纖維細(xì)胞，檢測細(xì)胞的增殖和凋亡，同時檢測轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、膠原（collagen，Col）、Smad2和Smad3的基因表達(dá)，為640 nm紅光治療妊娠紋提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞 人真皮成纖維細(xì)胞（SCIENCEL）

1.1.2 實驗試劑 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（諾唯贊生物科技股份有限公司，R401-01）、吉姆薩染色液（索萊寶，G1015）、臺酚藍(lán)染色液（索萊寶，C0040）、胰酶 -EDTA（索萊寶，T1300）、噻唑藍(lán)（GIBICO，M6494）、Trizol（ThermoFisher，15596026）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher，4368813）、ABsolute Blue QPCR Mix、SYBR Green、Low ROX（ThermoFisher，AB4323A），其他化學(xué)試劑為國藥產(chǎn)品。

1.1.3 實驗材料 6孔板（康寧）、96孔板（康寧）、PCR八連管。

1.1.4 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO，MC0-15AC）、生物安全柜（海爾，HR40-IIA2）、離心機（北京時代北利離心機公司，D75-2B）、酶標(biāo)儀（Thermo Fisher，MULTISKAN FC）、顯微鏡（北極光普佳科技有限公司，IM200）、PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，ETC811）、熒光定量PCR儀（ABI，Step One）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代 復(fù)蘇的細(xì)胞37℃水浴鍋中輕晃融化，轉(zhuǎn)入含有10 ml DMEM的離心管；1000 r/min離心5 min，倒掉上清液后，離心管中加培養(yǎng)基混懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶；細(xì)胞增殖到80%密度傳代。

1.2.2 細(xì)胞照射 待細(xì)胞培養(yǎng)至第三代后，分組進(jìn)行640 nm、25 mW/cm2紅光照射，分別以不同的照射時間（30、60、120 min）對培養(yǎng)孔進(jìn)行非重疊照射，每天照射一次，同時設(shè)定無照射組進(jìn)行對照比較。照射不同時間后，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，于 12、24、36、48、60、72 h收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性、細(xì)胞數(shù)量和基因表達(dá)水平的檢測。

1.2.3 熒光染色 細(xì)胞爬片用PBS浸洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗 3次，3 min/次；0.5% TritonX-100透化 20 min，PBS浸洗3次，3 min/次；山羊血清室溫封閉30 min，一抗（Vimentin）4℃孵育過夜；PBST浸洗3次，3 min/次，熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔 IgG，孵育 1 h，PBST浸洗3次，3 min/次；DAPI復(fù)染核后封片，并觀察采集圖像。

1.2.4 噻唑藍(lán)（MTT）檢測 細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，640 nm紅光照射分別照射30、60、120 min；對輻照后每組的 12、24、36、48、60、72 h 時間段進(jìn)行檢測，棄掉上清，添加5 mg/ml無菌MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清溶液，每孔添加150 μl無菌DMSO溶液，震蕩10 min左右，使結(jié)晶物充分溶解。檢測490 nm波長處吸光光度值，根據(jù)讀數(shù)判斷細(xì)胞增殖速度。

1.2.5 吉姆薩染色 細(xì)胞接種在六孔板的蓋玻片，培養(yǎng)3 d后甲醇固定10 min，蒸餾水浸洗2次，3 min/次；滴加稀釋好的吉姆薩染色液室溫染色15～30 min；自來水緩慢沖洗晾干后鏡檢。

1.2.6 臺酚藍(lán)染色 細(xì)胞接種在六孔板，培養(yǎng)3 d后消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液與0.4%臺酚藍(lán)溶液（9∶1）混勻，染色3～10 min；吸取少量染色細(xì)胞，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.7 實時熒光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，RT-PCR）法檢測 目的基因RT-PCR收集細(xì)胞，加入500 μl TRIZOL提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｄ康幕驍U(kuò)增，配制RT-PCR反應(yīng)液：2×mastermix（10.0 μl）、ForwardPrimer（1.0 μl）、ReversePrimer（1.0 μl）、Nuclease-free H2O（6.0 μl）。將 PCR 反應(yīng)液分裝于PCR八連管中，18 μl/管；加入2 μl制備好的cDNA；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行程序擴(kuò)增（表1），檢測基因的表達(dá)差異。基因溶解曲線用來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，基因循環(huán)數(shù)計算基因表達(dá)的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 人真皮成纖維細(xì)胞的鑒定

熒光染色后，Vimentin染色陽性率＞90%，即細(xì)胞純度＞90%，見圖1。

圖1 人真皮成纖維細(xì)胞熒光鑒定結(jié)果

2.2 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞周期的影響

2.2.1 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，同對照組相比，30、60、120 min的照射強度在細(xì)胞生長的前期對細(xì)胞的活性影響不顯著，但在細(xì)胞生長對數(shù)期影響顯著，對照組和照射組均在生長60 h時達(dá)到了細(xì)胞活性的最高點，且照射組細(xì)胞活性顯著高于對照組，照射120 min比照射30、60 min細(xì)胞活性更高。見圖2。

圖2 MTT活性檢測細(xì)胞生長曲線圖

2.2.2 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的影響 吉姆薩細(xì)胞染色結(jié)果顯示，每組的細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)良好，無顯著差異，染色細(xì)胞密度顯示30、60、120 min照射組細(xì)胞密度要大于對照組。見圖3。

圖3 各組培養(yǎng)不同時間染色

2.2.3 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞生長周期的影響 36 h后照射組細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組，且細(xì)胞生長60 h后逐漸進(jìn)入細(xì)胞凋亡期，而對照組生長72 h還未進(jìn)入細(xì)胞增殖的凋亡期，見圖4。通過對細(xì)胞存活率計算，對照組無死亡細(xì)胞，而照射組細(xì)胞存活率下降，不同照射強度之間細(xì)胞存活率無顯著差異，見圖5。

圖4 細(xì)胞計數(shù)生長曲線

圖5 培養(yǎng)72 h后細(xì)胞存活率

2.3 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的影響

2.3.1 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞TGF-β基因表達(dá)的影響 各組人真皮成纖維細(xì)胞TGF-β基因表達(dá)的比較，照射組48 h之前與對照組相比，TGF-β基因的表達(dá)降低，48 h之后表達(dá)逐漸升高，且照射60 min上調(diào)作用最為顯著。見圖6。

圖6 不同照射強度對人真皮成纖維細(xì)胞TGF-β基因表達(dá)的影響

2.3.2 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞COL基因表達(dá)的影響 同對照組相比，30 min和60 min照射組細(xì)胞COL基因表達(dá)升高，且其表達(dá)趨勢與對照組一致，而120 min照射組與對照組相比也顯著上調(diào)了細(xì)胞COL基因表達(dá)，且在照射48 h時細(xì)胞COL基因表達(dá)達(dá)到最高值，之后出現(xiàn)急劇下降。見圖7。

圖7 不同照射強度對人真皮成纖維細(xì)胞COL基因表達(dá)的影響

2.3.3 不同強度的640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞Smad-2、Smad3基因表達(dá)的影響 不同強度640 nm紅光照射對人真皮成纖維細(xì)胞Smad2基因的影響實驗結(jié)果顯示，照射30 min對人真皮成纖維細(xì)胞Smad2基因的表達(dá)無顯著影響；照射60 min時，細(xì)胞生長24 h時Smad2基因的表達(dá)達(dá)到高峰；而照射120 min時，細(xì)胞生長12 h和24 h時Smad2基因的表達(dá)均顯著高于對照組，36 h時達(dá)到最高點，之后開始急劇下降，可能是120 min照射強度增加了細(xì)胞毒效應(yīng)。見圖8。

圖8 不同照射強度對人真皮成纖維細(xì)胞Smad2基因表達(dá)的影響

Smad3基因的表達(dá)結(jié)果顯示，照射30 min和60 min，人真皮成纖維細(xì)胞Smad3基因表達(dá)上調(diào)；120 min照射組在細(xì)胞生長前期Smad3基因表達(dá)顯著上調(diào)，48 h之后表達(dá)明顯低于對照組，可能是120 min照射強度增加了細(xì)胞毒效應(yīng)；照射60 min細(xì)胞生長周期內(nèi)一直顯著高于對照組。見圖9。

圖9 不同照射強度對人真皮成纖維細(xì)胞Smad3基因表達(dá)的影響

3 討論

妊娠紋是由于女性懷孕過程膠原纖維牽拉斷裂形成的皮膚瘢痕線紋，妊娠紋的發(fā)生率高達(dá)60%～90%，影響著大約4億女性的正常生活[14]。妊娠紋的發(fā)生機制核心是膠原纖維和彈性纖維的減少，而成纖維細(xì)胞是其主要來源細(xì)胞[15]。因此，上調(diào)成纖維細(xì)胞的活性，促進(jìn)膠原纖維和彈性纖維的生成是治療妊娠紋的關(guān)鍵途徑。妊娠紋的治療方法包括藥物治療、手術(shù)治療、激光治療、射頻治療和紅光治療等[12，16]。640 nm紅光屬于中波段紅光，其治療妊娠紋的作用強度和對成纖維細(xì)胞的調(diào)控機制依舊不明確。所以，本研究選用不同強度的640 nm紅光照射人真皮成纖維細(xì)胞，探究紅光照射對細(xì)胞周期的影響以及對成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控機制。

不同強度640 nm紅光照射指數(shù)期的成纖維細(xì)胞，每隔12 h進(jìn)行細(xì)胞活性及表達(dá)因子基因的檢測，檢測至照射后72 h。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，640 nm紅光照射顯著上調(diào)細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞數(shù)量。640 nm紅光照射能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，從而增加生成膠原的細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)膠原的產(chǎn)生，膠原的產(chǎn)生能修復(fù)妊娠紋。MTT活性結(jié)果顯示，照射組細(xì)胞均在60 h時達(dá)到細(xì)胞生長的穩(wěn)定期，72 h之后進(jìn)入衰亡期，而對照組的MTT活性、細(xì)胞計數(shù)以及細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，對照組在60 h進(jìn)入穩(wěn)定期，72 h還未進(jìn)入衰亡期，本實驗結(jié)果表明640 nm紅光照射可顯著提升細(xì)胞的增殖活性，縮短細(xì)胞的生長周期。640 nm紅光照射組和對照組細(xì)胞因子基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示，640 nm紅光照射顯著上調(diào)了人真皮成纖維細(xì)胞TGF-β的表達(dá)，同時調(diào)控了膠原蛋白基因的表達(dá)上調(diào)，且照射60 min對細(xì)胞的增殖活性作用最顯著。本研究需要進(jìn)一步完善紅光照射誘導(dǎo)膠原纖維生成的分子調(diào)控機制，為紅光治療妊娠紋提供強有力的理論基礎(chǔ)。

綜上，在本實驗中發(fā)現(xiàn)640 nm紅光照射療法具有時間和劑量依賴性。60 min的紅光照射時長，照射效應(yīng)積累48～60 h時即可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞的增殖活性。本研究結(jié)果為640 nm紅光治療妊娠紋提供了理論基礎(chǔ)。