兩種常用老年癡呆大鼠模型制備方法對比

韓 寧 劉興林 臺雪姣

1.湖北醫藥學院基礎醫學院藥理學教研室，湖北十堰 442000；2.湖北醫藥學院實驗動物中心，湖北十堰 442000；3.湖北醫藥學院基礎醫學院病理學教研室，湖北十堰 442000

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病[1]，目前對AD的治療尚無有效方法[2]。因此，迫切需要研發出有效的AD治療藥物，而藥物開發的前提是具有理想的動物模型。目前公認的AD模型有APP轉基因小鼠模型、β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）動物模型、慢性鋁過負荷致癡呆模型等。以上都是當前AD研究中較為常用的動物模型，但轉基因模型所需成本較高。通過查閱文獻發現對于Aβ動物模型和慢性鋁過負荷致癡呆模型的研究，其結果差異較大尚未形成統一的結論。本研究通過比較當前常用的兩種AD模型，尋找AD研究中最佳的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠65只[實驗動物批號：SCXK（鄂）2019-0008]，湖北醫藥學院實驗動物中心提供，體重（240±20）g。

1.1.2 藥物及儀器 Aβ25-35（上海睿安生物科技有限公司，A4559）、大鼠腦立體定位儀（成都泰盟軟件有限公司，DW-5）、WMT-100S水迷宮視頻分析系統（成都泰盟軟件有限公司，WM-100S）。

1.2 實驗方法

1.2.1 Aβ25-35孵育方法 Aβ25-35在體內并不存在，但其神經毒性與Aβ幾乎相同。研究表明Aβ的神經毒性主要集中在中段，因此可采用側腦室注射Aβ25-35制備癡呆動物模型。在使用前將Aβ25-35溶解于無菌雙蒸水中形成濃度為2 g/L的溶液，37℃孵育100 h使其成為不可溶解的纖維狀[3-4]。

1.2.2 預實驗 隨機選取SPF級雄性SD大鼠20只分為兩組，一組給予Aβ25-35側腦室注射，另一組給予D-半乳糖和亞硝酸鈉頸背部皮下注射，三氯化鋁飲用。希望實驗人員熟練掌握兩種造模方法。

1.2.3 模型制備及給藥方式 將動物隨機分為三組，每組各15只。模型Ⅰ組動物用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉。顱頂部做正中矢狀切口，暴露前囟。于前囟后1.5 mm，矢狀縫右旁開1.5 mm處鉆開顱骨，垂直進針，達腦表面下3.5 mm，緩慢給予Aβ25-35溶液3 μl，縫合皮膚。模型Ⅱ組采用D-半乳糖、亞硝酸鈉及三氯化鋁聯合給藥。將三種藥物配制成水溶液，前兩種按照45 mg/（kg·d）、500 mg/（kg·d）皮下注射，后者以 40 mg/（kg·d）飲用，連續1個月。正常組操作相同，藥物均改為生理鹽水。

1.2.4 水迷宮實驗觀察大鼠學習記憶能力 造模后1周開始水迷宮實驗。前4 d行定位航行實驗，水溫25℃。將水迷宮分為四個象限，平臺固定于第一象限。每只大鼠1 d接受兩次訓練，記錄大鼠找到平臺的時間。第5天行空間探索實驗，撤去平臺，讓大鼠自由游泳60 s尋找平臺。記錄大鼠第一次跨越平臺時間和平臺所在象限停留時間。5周后再次行水迷宮實驗。

1.2.5 大鼠存活率檢測 記錄各組大鼠在造模后48 h和40 d內的存活率。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，大鼠存活率以百分數（%）表示，采用χ2檢驗。計量資料以（）表示，采用方差分析。水迷宮定位航行實驗、水迷宮空間探索實驗結果采取方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠存活率比較

造模后48 h內，各組大鼠均無死亡。造模后40 d內，正常組大鼠死亡0只，模型Ⅰ組大鼠死亡2只，模型Ⅱ組大鼠死亡0只。三組大鼠48 h、40 d內存活率比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組大鼠存活率比較

2.2 三組水迷宮定位航行實驗結果

造模后一周，與正常組相比，模型Ⅰ組、模型Ⅱ組大鼠的第1天逃避潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05），后3 d逃避潛伏期較長且差異有統計學意義（P＜0.05）。模型Ⅰ組、模型Ⅱ組比較，第3、4天大鼠逃避潛伏期比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。造模后5周，模型Ⅰ組與正常組相比差異無統計學意義（P＞0.05），而模型Ⅱ組與正常組相比第1、2天差異無統計學意義（P＞0.05），但第3、4天差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表 3。

表2 三組造模后1周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

表2 三組造模后1周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型Ⅰ組比較，*P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天正常組 45.1±6.2 28.7±3.3 17.0±4.3 16.5±4.1模型Ⅰ組 48.4±4.7 39.1±4.6# 33.2±3.1# 27.3±3.2#模型Ⅱ組 45.5±5.9 36.1±4.9# 27.1±2.2*# 22.0±2.6*#F值 0.875 17.843 38.247 24.873 P值 0.791 0.023 0.000 0.000

表3 三組造模后5周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

表3 三組造模后5周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

注：與正常組比較，#P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天正常組 43.1±5.1 26.5±3.8 15.0±3.8 13.6±4.5模型Ⅰ組 44.6±4.3 28.1±4.3 17.3±4.2 15.1±3.4模型Ⅱ組 45.2±6.4 33.5±4.7 25.4±4.2# 20.7±3.3#F值 2.371 1.639 25.384 19.870 P值 0.285 0.592 0.013 0.032

2.3 三組水迷宮空間探索實驗結果

造模后1周，兩模型組大鼠的第一次穿越平臺時間和平臺所在象限停留時間與正常組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型Ⅰ組相比，模型Ⅱ組大鼠第一次穿越平臺時間較短且在平臺所在象限停留時間長，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。造模后5周，模型Ⅰ組大鼠的第一次穿越平臺時間和平臺所在象限停留時間與正常組相比差異均無統計學意義；模型Ⅱ組與正常組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表4 三組造模后1周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

表4 三組造模后1周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型Ⅰ組比較，*P＜0.05

組別 第一次穿越平臺時間 平臺所在象限停留時間正常組 15.2±2.9 26.7±3.0模型Ⅰ組 29.6±3.2# 15.3±2.5#模型Ⅱ組 23.2±3.1*# 21.2±3.4*#F值 12.657 17.382 P值 0.000 0.012

表5 三組造模后5周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

表5 三組造模后5周水迷宮定位航行實驗結果（，s）

注：與正常組比較，#P＜0.05

組別 第一次穿越平臺時間 平臺所在象限停留時間正常組 12.5±4.0 20.7±2.4模型Ⅰ組 14.6±3.2 18.6±2.3模型Ⅱ組 21.8±4.1# 15.2±3.4#F值 20.543 13.279 P值 0.034 0.000

3 討論

AD也稱為老年癡呆，隨著年齡的增加其發病率逐漸增高[5-6]。中國是世界上AD患者基數最大的國家，也是人口老齡化速度最快的國家之一[7]。所以對AD的研究刻不容緩，而合理有效的動物模型是疾病實驗研究的基礎。大鼠比較接近靈長目動物，在人類神經疾病的模擬方面具有天然優勢且其在造模過程中生存率較高，因此成為制備AD模型的常用動物[8]。

目前，AD的發病機制存在多種假說。如Aβ毒性假說、膽堿能神經元假說、tau蛋白假說等[9]，但其發病機制并不明確。而AD的病理改變非常明確，主要是Aβ聚集形成的老年斑、神經纖維纏結和神經元死亡[10-11]。因此，AD理想的動物模型是動物腦組織出現類似AD患者的腦部病變。

本研究采用的兩種動物模型都是經典的AD模型。研究表明Aβ在AD的發生發展中起著重要作用[12-13]，且在Aβ聚集區發現高濃度的金屬離子，如鋁、銅、鐵等[14]，推測其與AD的發生有關。同時，鋁可促進Aβ結構轉變，加速Aβ生成和聚集[15]。除此之外，D-半乳糖是動物體內存在的一種糖，當含量過高時會轉化為活性氧，導致機體出現氧化應激。亞硝酸鈉在體內可轉化為亞硝酸對神經系統產生毒性。因此，本實驗主要比較側腦室注射Aβ25-35和聯合給予D-半乳糖、亞硝酸鈉及三氯化鋁兩種造模方法，選取出更適合AD研究的動物模型。

實驗開始前展開預實驗。分別選取10只大鼠采用兩種不同造模方法進行預實驗。側腦室注射Aβ25-35死亡率為40%，另一種造模方法未出現動物死亡。分析發現，側腦室注射Aβ25-35時需要腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉過程中出現麻藥直接注射到腸腔引起腸梗阻導致大鼠死亡。為減少死亡率，再次實驗前對實驗人員進行統一培訓。結果表明，統一培訓后，兩種造模方法存活率無明顯差異。水迷宮實驗結果顯示，在造模后1周，兩模型組大鼠學習記憶能力均有明顯損傷，但側腦室注射Aβ能夠在短期內更有效地損傷大鼠的認知能力。在造模后第5周，側腦室注射Aβ的學習記憶能力與正常組相比差異無統計學意義，說明其學習記憶能力在造模后的第2～5周逐漸恢復。而聯合給予D-半乳糖、亞硝酸鈉及三氯化鋁的大鼠其學習記憶能力損傷依然存在。實驗結果表明，側腦室注射Aβ的大鼠認知能力受損主要表現為急性損傷，適用于短期研究；聯合給予D-半乳糖、亞硝酸鈉及三氯化鋁的大鼠其認知能力損傷能夠保持較長時間，適用于AD的長期研究。