生物樣品中唾液酸和神經節苷脂的測定

摘要：神經節苷脂屬于神經鞘脂類，結構中含有一種或多種唾液酸，是神經細胞膜的重要組成成分。神經節苷脂和唾液酸都是具有生物活性的化合物。由于它們具有生物相關性，因此與每種基質相對應的分析方法也都得到了一定的發展。本文就生物樣品中適用于唾液酸和神經節苷脂的主要分析方法做一下總結概述。

關鍵詞：生物樣品 ;唾液酸;神經節苷脂

神經節苷脂是一類含有唾液酸的酸性鞘糖脂 ，是神經細胞膜的重要組成成分，結構中含有一種或多種成分的唾液酸，更確切的說，神經節苷脂是由鞘氨基醇與脂肪酸相結合，然后通過酰胺鍵連接到包含一種或多種唾液酸的低聚糖鏈上。在物理條件下，唾液酸分子中含有一個負電荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年來，隨著對細胞膜表面糖類生理功能研究的日益重視，神經節苷脂的研究也日趨受到科學界的關注，特別是隨著神經生物化學和神經藥理學的發展，對神經節苷脂的代謝及其生物學作用研究已經成為神經科學的重要課題。神經節苷脂在國內大多數依賴進口，雖然國內外已報道了多種分離純化的方法，但大多都有操作步驟繁瑣、溶劑用量大等不足之處。目前國內外的研究主要集中于其與生物膜其他有效成分之間的相互作用，而對神經節苷脂的分離方法的最佳選擇未給予詳細的報道。因此，本文就多種分離純化方法做一下比較總結，對其分離過程起到一定的幫助。

一、 唾液酸的測定

1.分光光度法

應用最廣泛的分光光度法是由Svennerholm發明的，后人對這種方法又做了一定的修正，即用陰離子交換法來提高純度。采用這種方法時在蔗糖與間苯二酚之間發生反應。由于唾液酸是糖脂類神經節苷酯物質所含有的特征基團，因此當與間苯二酚反應生成紫色復合物可用于神經節苷脂的含量測定。本法主要用于人體組織和生物體液的檢測，但一些研究者已經將其用于乳制品檢測當中，如牛奶制品和嬰兒奶粉的檢測。

2.液相色譜法

液相色譜法也是測定唾液酸較常用的方法，當樣品沒有被衍生化的時候，最常用的方法就是紫外檢測離子對的方法。這種方法最初是由Spyridiaki與Siskos聯合研究出來的]，他們通過實驗模擬提高了以下物質檢測時的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙酰基-9-O-乙酰神經氨酸等。在分析中使用了多種親脂的陽性離子對，如四辛基溴化銨（TOA-Br）三異丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用時一般選用TIP，因為它的強度和分離度更好，但在操作中必須要注意PH的控制，（最佳值為3.5），這是決定因素。但是實驗發現，當這種方法應用到血清、尿液、唾液當中時，只能區分兩種形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en），在純化步驟中必須除去蛋白質。由于其限制條件較多，因此在分析結構較多的唾液酸混合物時不推薦使用本方法。

3.氣相色譜法

氣象色譜法（GC）與質譜法聯用起初是用來鑒定苷脂鍵及衍生反應后的氧代神經氨酸，Zanetta等人在此基礎上研究了一種非常有效的方法，用來測定唾液酸標準液及生物體液如馬血清及牛、羊、馬的下顎下腺粘蛋白等]。這種方法是在無水甲醇和使用七氟酸酐形成的揮發性衍生物存在的前提下，通過重氮甲烷酐的甲基酯化進行氣相色譜/質譜電子轟擊的。這種方法能夠區分大部分的唾液酸，包括O -酰化的Neu5Ac，Neu5Gc和8-O-鄰甲基和8 - O -硫酸衍生物以及1，7 -唾液酸內酯。在后面的研究中，這個研究小組對本方法做了小的修改，從而對單糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素當中可以更好定位。樣品仍可以用相同的反應容器，并按照分析唾液酸的方法用GC /質譜進行分析。相對于上面的方法，本法的測定范圍更加全面，其應用前景也更加廣泛。

二、神經節苷脂的測定

總神經節苷脂量可以通過分離純化唾液酸內容物來定量，量化結果可以用脂鍵聯合唾液酸的方式表達。

1.質譜分析測定

質譜（MS）能夠利用薄層色譜與高效液相色譜板來鑒別及定量神經節苷脂，雖然這種方法的靈敏性較TLC/HPTLC免疫染色法低，但這兩種方法都可以作為薄層掃描法測定神經節苷脂的補充方法。薄層色譜法與快原子轟擊（FAB）及質譜連用的優點歸因于FAB-MS與氣相、液相及超臨界流體色譜儀是從生物反應表面得出結果的最有效方法。TLC-FAB-MS連用效率高且省時，但條件是仍然需要大分子的解吸附來增加靈敏度，并盡量減少基質中離子源的污染。因此，這種方法對樣本的要求很高，在實際的應用中也會受到一定的限制。

2.液相色譜法與質譜法聯用

近幾年，一項液相色譜法與質譜法連用的技術逐步發展起來，實驗證明，這種方法能夠用于牛奶及嬰兒配方中的神經節苷脂中GD3 和 GM3的測定。其GD3與GM3的重現性分別小于5%和14%，其覆蓋范圍在83%到87%之間。由于本法的重現性比較低，所以不建議直接應用，在進一步研究及改進之后，相信本方法會成為一種可靠的分析方法應用到實際操作中去。

三、結論

分光光度法不僅可以將生物試樣中的唾液酸進行定量分析，還可以將總神經節苷脂量進行分析測定，因此現在仍然是主要的分析方法。其應用方式主要為脂類與唾液酸的聯合應用。而色譜技術能夠將兩種主要結構的唾液酸進行區分，這種方法不僅可以測定樣品的原始數據還可以檢測在臨床環境中唾液酸代謝情況的變化（如癌癥的早期診斷）。

神經節苷脂在生物試樣中的檢測都需要一系列冗長的準備工作，如提取、分離以及純化工作，但這又是最關鍵性的操作步驟，因為這些步驟可以從根本上反應出實際的損耗，要將所有干擾源消除非常困難，只能盡量減少。所以在分析過程中，一定要認真將此前期工作認真準備。

神經節苷脂測定的未來趨勢是利用質譜分析來闡釋所有結構的神經節苷脂、糖鏈、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且調節他們的生物活性。本文對多種分析方法做了分析與比較，為神經節苷脂的開發利用提供了理論和一定的實驗依據，這就是分析所有鑒別方法的意義所在。

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作者簡介：

高靜（1985.09--），女，漢族，山東淄博人，工程師，碩士研究生，主要從事藥物化學、制藥工程等研究