產腸毒素大腸桿菌K88 誘導BALB/c 小鼠空腸損傷的機制研究

楊 陽，黃興法,2，王東方，劉玉蘭，胡 進*

（1.武漢輕工大學動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.中南民族大學生命科學學院，武陵山區特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074）

產腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）是引起新生動物如仔豬、犢牛、羔羊等腹瀉的主要病原菌之一[1]，其致病性主要與其具有宿主特異性的菌毛粘附素（Fimbrias）和黏附后分泌的腸毒素（Enterotoxinsl）相關[2]，含有K88 菌毛的大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要病原，有研究發現ETEC K88 感染仔豬后能夠激活仔豬腸道上皮細胞TLR2/4-MyD88 信號通路，導致仔豬腸系淋巴結出血與腸道炎癥[3]。在小鼠模型上研究結果表明，ETEC K88 感染小鼠后能夠激活小鼠TLR2/4 信號通路，促進小鼠腸道炎癥基因表達，引起小鼠腸道損傷與腹瀉[4]。隨著研究的不斷深入，人們發現ETEC K88 不僅可通過促進淋巴細胞[5]、中性粒細胞、巨噬細胞在小鼠腸道與各組織器官上的聚集，還可通過誘導細胞變性，引起組織出血或水腫[6]，引起小鼠腸道組織損傷以及全身特異性免疫反應[7-10]。ETEC K88 還可激活小鼠腸道NF-κB 信號通路或Caspase3 相關的凋亡信號通路誘導腸道炎癥和細胞凋亡進而導致腸道損傷[11]。然而目前并沒有ETEC K88 與焦亡信號通路相關性的報道。焦亡是一種由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶11（Caspase-11）介導的細胞死亡方式[12]，當機體受到外界刺激后，核苷酸會結合NLRs 與未活化的ASC 形成炎性復合體，進一步激活Caspase-1 促使其剪切焦亡效應分子（GSDMD）導致炎性因子IL-1β和IL-18 的釋放，引起細胞焦亡[13]。活化的Caspase-11 同樣能剪切GSDMD 形成GSDMD-N 端結構域寡聚化誘導焦亡。本試驗采用腹腔注射ETEC K88 菌液感染小鼠，研究ETEC K88 對小鼠造成的空腸損傷以及感染后第36 h 小鼠空腸內炎癥、焦亡相關基因的表達情況，探討ETEC K88 導致小鼠腸道損傷的機制，為防控和治療ETEC K88 引起的腸道損傷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 ETEC K88（血清型為O149:K91:K88ac）購于中國獸醫藥品監察所；BALB/c 小鼠購于北京維通利華公司；電子天平（沈陽龍騰ESK-1 系列）購于龍騰公司；Total RNA 提取試劑、cDNA 合成試劑盒、Real-time PCR 試劑盒均購于大連寶生物工程有限公司；7500 Real-time PCR 儀購于Applied Biosystems 公司；梯度升降溫功能PCR 儀購于TaKaRa 公司。

1.2 菌株培養 取10 μL ETEC K88 菌株甘油保存液接種在TSA 固體培養基上復蘇，37℃條件下靜置培養12 h，挑取復蘇單菌落接種在TSB 液體培養基上復壯，37℃條件下靜置培養10 h 后采用濃度梯度稀釋法將菌液10倍稀釋進行活菌計數。

1.3 飼養管理 將小鼠飼養在標準無特異性病原體（SPF）的鼠房中，溫度控制在（22±3）℃，晝夜周期為12 h，允許小鼠自由采食。飼喂3 d 后進行正式試驗。

1.4 試驗設計 選取25 只體重（17±1）g 的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射1×107CFU/mL ETEC K88 溶液0.2 mL。注射完成后持續觀察小鼠48 h，每隔12 h對小鼠的體重與活動指數進行一次統計。在該試驗得出的最適感染時間基礎上，重新選取10 只體重（17±1）g的雌性BALB/c 小鼠，感染后36 h 屠宰小鼠，采集小鼠空腸進行組織形態學分析和RNA 檢測。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 小鼠體重與疾病活動指數評分 ETEC K88 感染小鼠后進行持續觀察，每隔12 h 對小鼠的體重進行統計。參照齊宇等[5]所述方法對小鼠體重下降率、糞便黏稠度、便血情況進行評分，取3 項觀察評分的平均值作為小鼠疾病活動指數進行統計（表1）。

表1 小鼠DAI 評分標準

1.5.2 小鼠空腸組織病理學觀察 感染后0 h 和36 h 屠宰小鼠，收集小鼠空腸中段，放入4%多聚甲醛進行固定，用蘇木素-伊紅（HE）染色后對小鼠腸道進行形態學分析，采用正置光學顯微鏡在目鏡和物鏡分別為10 倍和40 倍下拍照保存圖片，采用HPIAS 高清晰度彩色病例圖文報告分析系統進行腸道損傷分析。

1.5.3 mRNA 表達量測定 檢測指標為炎癥、焦亡相關基因，測定步驟參照陳逢[14]。以NCBI 數據庫中下載的小鼠基因組序列為模板，采用引物設計軟件Premier 6.0 設計引物，委托武漢擎科生物技術公司進行合成，引物序列詳見表2。Real-time PCR 操作方法參考陳少魁[15]。Real-time PCR 數據分析以肌動蛋白（β-actin）為內參基因，參考livak 的2-ΔΔCt計算方法進行計算[16]。

表2 基因的引物序列

1.6 統計分析 本試驗數據采用SPSS 22.0 進行獨立樣本T 檢驗和單因素ANOVA 檢驗。統計結果采用平均值± 標準誤來表示，以P<0.05 表示顯著性差異。圖表采用Graphpad Prism 8.0.2 繪圖軟件進行制作。

2 結果

2.1 ETEC K88 感染后小鼠臨床癥狀 感染ETEC K88后各時間點小鼠均表現出精神不振、行動遲緩、進食飲水頻率降低等癥狀，其中以36 h 最為明顯。小鼠體重隨感染時間延長而下降，在36 h 降至最低值，隨后出現逐漸恢復（圖1）。隨著小鼠體重下降，小鼠糞便出現變形、水分增多等臨床變化，但在0～48 h 的連續觀察中并未發現糞便隱血狀況。DAI 指數在36 h 達到最高點2.0，隨后呈現下降趨勢（圖2）。

圖1 小鼠體重變化

圖2 小鼠DAI 指數

2.2 ETEC K88 感染后小鼠空腸病理學觀察 ETEC K88感染引起小鼠空腸損傷，與對照組（0 h）相比，ETEC K88 感染后36 h 引起了小鼠空腸充血、毛細血管出血與炎性細胞浸潤。感染組空腸內中性粒細胞、淋巴細胞與漿細胞數量顯著高于對照組（圖3）。

圖3 小鼠空腸切片（HE，40×10）

2.3 ETEC K88 刺激對小鼠腸道炎癥基因mRNA 表達量的影響 由表3 可知，與對照組相比，ETEC K88 刺激36 h 后引起了小鼠空腸炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA 表達量升高（P<0.05）。

表3 ETEC K88 對小鼠空腸IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA 表達量的影響

2.4 ETEC K88 刺激對小鼠腸道焦亡關鍵基因的影響由表4 可知，與對照組相比，刺激組（36 h）小鼠空腸GSDMD的mRNA 表達量上升（P<0.01），IL-18的表達量有上升的趨勢（P<0.10），而Caspase-1、ASC、NLRP3的mRNA 表達量差異不顯著。

表4 ETEC K88 對小鼠空腸焦亡信號通路關鍵基因mRNA 表達量的影響

3 討 論

ETEC K88 是一種常見的致病性大腸桿菌，已有眾多文獻報道了其菌毛粘附素、耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素的分子結構與合成機制[17-18]，但在其致病性的研究上目前尚未完全透徹。目前大部分研究從體外角度報道了ETEC K88感染對腸道上皮細胞造成的損傷及其機制[19]，但對ETEC K88 侵入機體引起的動物體炎癥并激活相關信號通路的研究較少。張賽群等[1]研究發現腹腔注射ETEC K88 能夠誘導小鼠發生顯著的病理反應與組織損傷，不僅在腹腔臟器以及腸上部發現ETEC K88 黏附，在胸腔臟器以及腦、肌肉、血液中都能檢測到ETEC K88 聚集，這表明ETEC K88 的致病性不僅與其產腸毒素相關，ETEC K88 的黏附性與侵襲性也應作為致病因素之一進行討論。本試驗中腹腔注射ETEC K88 引起小鼠空腸內炎性細胞浸潤、毛細血管出血與空腸充血，誘發腸道炎癥，這些現象證實了ETEC K88 在腸外也能發揮其致病性。

Jiang 等[20]研究發現腹腔注射ETEC K88 能誘導6～8 周齡雄性ICR 小鼠的腸道炎癥，ETEC K88 刺激提高了小鼠回腸中部IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、干擾素（IFN-γ）等促炎細胞因子的表達，并且抑制了抗炎細胞因子IL-10的mRNA 表達。本試驗中，ETEC K88感染引起小鼠空腸中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子表達。兩個試驗雖然檢測的腸段不同但結果具有相似性，表明ETEC K88 感染對小腸段造成的損傷較嚴重。本試驗發現ETEC K88 刺激上調了小鼠空腸中焦亡相關基因GSDMD和IL-18的表達量并導致腸道損傷，目前研究已發現微生物感染能激活動物體腸道焦亡信號通路，被激活的焦亡信號通路又參與到促炎因子釋放與溶酶體損傷過程中，最終導致腸道屏障損傷[21]。這表明ETEC K88 刺激與焦亡存在必然的聯系。而且在細胞水平上，革蘭氏陰性菌組分LPS 能夠激活Caspase11相關的焦亡信號通路，引起腸細胞死亡[22]。綜上所述，ETEC K88 激活了小鼠空腸焦亡信號通路，促進了炎性因子的釋放并破壞腸道屏障完整性從而引起了空腸損傷。

4 結 論

本試驗結果表明，ETEC K88 感染小鼠后，空腸炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平升高，同時焦亡信號通路中GSDMD的mRNA 表達量顯著上升，IL-18的mRNA 表達量有上升趨勢。病理切片結果顯示感染組空腸充血、毛細血管出血與炎性細胞浸潤，空腸內聚集有大量中性粒細胞、淋巴細胞與漿細胞。表明ETEC K88 感染可上調焦亡信號通路相關基因的表達量引起小鼠的腸道損傷，誘發腸道炎癥。