雞糞發酵液中總游離氨基酸的粗提取及茚三酮法檢測

徐先洲，祝 苑，胡 瑞，李建芬，何 贠，申文娟

（武漢輕工大學化學與環境工程學院，湖北武漢 430024 ）

近年來，隨著生活水平的提高，國人對雞肉及其附屬品的需求量大幅增加。我國是肉雞消費大國，據國家統計局數據顯示，2019 年，我國禽蛋產量為308.98 萬t，較2018 年增加5.78%[1]。一只成年雞每天產糞量是80 g，以一個10 萬只養殖規模的現代化養雞場為例，每天的產糞量在8 t 左右[2]。雞的直腸較短，消化能力有限，排出的糞便中含有較多未被及時消化吸收的有機物質以及一定量的抗菌藥和抗生素殘留[3]，若處理不妥當，將會造成較大的資源浪費和環境問題。

自1958 年氨基酸分析實現自動化至今[4]，紫外-可見分光光度法[5]、氣相色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8]、液相色譜法和質譜聯用法[9-11]以及毛細管電泳法[12]檢測氨基酸相繼被報道。其中，紫外-可見分光光度法可檢測總量氨基酸，但準確度相對不高；其他方法可得到氨基酸各組分定性定量分析，但成本較高。茚三酮-可見光光度法可快速低成本檢測總量氨基酸，并且檢測上限高[13]。

茚三酮法檢測氨基酸難點在于還原性茚三酮的生成[14,15-19]，為解決這一問題，常用通過加氯化亞錫和抗壞血酸等還原性物質，結合避免檢測時雜質粒子的干擾[15]，本研究通過添加抗壞血酸的方法成功解決了這一問題。本文通過蛋白酶水解法提高總游離氨基酸的產率，利用雙水相萃取法提取氨基酸，運用改進的茚三酮法對其進行定量檢測，為雞糞的資源化提一條較合理的路線。

1 材料與方法

1.1 試驗器材與設備

1.1.1 原料及試劑 雞糞發酵液來源于湖北迪匯科技有限公司，該公司將收集的新鮮雞糞進行初步殺菌處理，過濾去除D ≥2 mm 殘渣，剩余液經過蛋白酶發酵水解即得到雞糞發酵液，以提高游離氨基酸產量。

賴氨酸（α-Lys）、蘇氨酸（α-Thr）、硫酸銨、聚乙二醇-4000、抗壞血酸、氯化亞錫、茚三酮、三水乙酸鈉、冰乙酸、氨水、濃硫酸、硫酸銅均為分析純（國藥）；溴化鉀光譜純（國藥）；堿性蛋白質水解酶為工業用品，實驗室用水為去離子水。

雞糞發酵液中揮發性有機化合物（VOC）采用吹掃補集法測得，脂類由乙醚提取法測定，纖維素由酶發酵法測得，粗蛋白由凱氏定氮法測得[20]，發酵液中的沙石量由過濾獲得的殘渣在600℃下煅燒4 h 稱重得到，無機鹽由發酵液于600℃下煅燒4 h 除去沙石的質量稱取。經分析，雞糞發酵液由89%的水分，9%的有機物（干重）和2%的無機物（干重）組成，有機物中揮發性有機物、脂類、粗蛋白質、纖維素、其他有機物的質量百分比分別為4.4%、4.2%、57.8%、31.2%、2.4%，無機物中沙石、無機鹽的質量百分比分別為67%、33%。

1.1.2 試驗儀器 實驗使用的主要儀器見表1。

表1 主要儀器

1.2 實驗方法

1.2.1 雞糞發酵液前處理 取200 mL 雞糞發酵液真空抽濾4 h 除臭，取過濾液50 mL 加入0.50 g 蛋白酶（堿性），在44℃的磁攪拌油浴鍋以200 r/min 轉速水解，水解后的樣品3 200 r/min 離心12 min，取上清液快速過0.45 μm 濾膜待用。

1.2.2 雙水相萃取 配置質量分數為14%的硫酸銨和質量分數為15%的聚乙二醇（PEG）-4000 作為雙水相萃取劑，萃取過濾液，溶液分為有機相和無機相，氨基酸大量分布于有機相PEG-4000 中。此雙水相萃取游離氨基酸，可更好地保留其活性[21-23]。

1.2.3 氨基酸提取 萃取得到的有機相過強酸處理的離子交換柱后，用蒸餾水洗至出水無色，經收集后，用1 mol/L 的氨水洗脫至出液無色的洗脫液，于72℃水浴鍋中蒸發至5 mL 待測。

1.2.4 氨基酸標準液 準確稱取0.500 0 gα-Lys 和0.500 0 gα-Thr 定容至1 L，得到氨基酸標準液，取40 mL 標準液稀釋至100 mL 得氨基酸標準使用液。

1.2.5 氨基酸檢測液 顯色劑：配置質量分數為2% 的茚三酮溶液A，質量分數為0.1%的抗壞血酸溶液B，5份A 與1 份B 充分混勻后即得顯色劑。

緩沖液：配置1 mol/L 的乙酸鈉和乙酸溶液，取60 mL 乙酸鈉溶液和40 mL 乙酸溶液配成pH=4.8 的緩沖溶液。

氨基酸檢測原理及測試：游離氨基酸上的氨基會與具有還原性的茚三酮溶液在沸水浴下反應生成紫色化合物，該化合物在570 nm 處有最大吸光度。記錄石英比色皿中樣品的吸光度，每組樣品做3 個平行樣。

1.2.6 不同溫度下游離總氨基酸產率的測定方法 在50 mL原樣中加入5 g 堿性蛋白酶，分別在38、40、42、44、46、48、50、52℃水解2 h，測其總游離氨基酸濃度。

1.2.7 水解時間對氨基酸產率 雞糞發酵液分別在42、44、46℃下水解48 h，前24 h 每隔1 h 取1 次樣，24～48 h間歇取樣，測定游離氨基酸濃度。雞糞發酵液為實驗用到的原液，經過蛋白酶水解后，原液中以多肽和蛋白質存在的非游離氨基酸水解成游離氨基酸，增加產率。

1.2.8 總游離氨基酸檢含量隨月份的變化規律 在實驗室條件下，對原樣中的總游離氨基酸按月份進行測試，分別檢測7、8、9 月和10 月雞糞水解液中總游離氨基酸含量，查詢不同月份的白天最高平均氣溫繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶水解溫度對氨基酸產率的影響 蛋白酶在不同水解溫度下水解蛋白質2 h 后，對總游離氨基酸產率的影響如表2 所示。氨基酸產率在38～44℃時隨著蛋白酶水解溫度的升高而逐步提高，46～52℃時氨基酸產率逐步降低。在溫度為44℃時，蛋白水解酶水解蛋白質2 h蛋白質產率達65.08 mg/mL。

表2 蛋白酶在不同水解溫度下對總游離氨基酸產率的影響 mg/mL

2.2 蛋白水解時間對氨基酸產率的影響 水解時間對氨基酸產率的影響如圖1 所示，前10 h，溫度對氨基酸的水解效率影響并不大，隨著水解時間的延長，溫度的影響逐漸顯現出來，不同溫度下水解效率為：η（44℃）>η（46℃）>η（42℃）。同時，不同溫度下，隨著水解時間的延長，水解效率逐漸提高，氨基酸產率也隨之逐漸升高；隨后增長趨勢放緩；水解反應進行到48 h 后，氨基酸含量在44℃、46℃、42℃時分別達到133.04、129.62、123.64 mg/mL，遠高于從棉粕廢水[24]中提取游離氨基酸的結果（產率54 mg/mL）。這是因為雞糞水解液中蛋白質和多肽的水解與氨基酸的脫水縮合同時進行；剛開始時，雞糞水解液中的蛋白質和多肽濃度較高，遠高于水解液中氨基酸的量，在蛋白酶水解作用下，氨基酸生成量較高；根據水解原理和質量作用定律，隨著水解時間延長，雞糞水解液中的蛋白質和多肽逐漸降低，氨基酸含量逐漸升高，由于蛋白酶的加入同時加速了蛋白質水解與氨基酸脫水縮合正逆反應的進行，因此隨著反應的進行，雞糞水解液中氨基酸含量增多，抑制了蛋白質水解反應的正向進行，氨基酸脫水縮合逆反應增強，氨基酸的產生速率變緩。由于水解反應和脫水縮合是可逆反應，故雞糞發酵液中多肽和蛋白在蛋白酶加熱條件下，蛋白質和多肽的水解反應與氨基酸脫水縮合同時進行，并隨著水解時間的延長而趨于平衡，因而氨基酸產率在水解開始時升高較快，水解反應進行到48 h 后，氨基酸含量的增長趨勢放緩。

圖1 水解時間對氨基酸產率的影響

2.3 總游離氨基酸含量隨月份的變化規律 總游離氨基酸含量隨月份的變化規律圖如圖2 所示，7 月雞糞發酵液中游離的氨基酸含量為15 mg/mL，經過預處理后，原樣中的總游離氨基酸含量變高，排除雜質粒子的干擾，推測蛋白質和多肽存在自發的水解，水解效率不高，平均1 個月氨基酸含量增加1 mg/mL。

圖2 總游離氨基酸含量隨月份的變化規律

2.4 氨基酸產品的FTIR 分析 圖3 為44℃下經堿性蛋白酶水解2 h 得到的游離氨基酸的FTIR 圖，3 448 cm-1處中強而寬的吸收帶是N-H 伸縮振動峰，3 400～2 500 cm-1強且寬的吸收帶是羧酸γ（OH）的伸縮振動峰，1 637 cm-1處較弱而尖銳的是NH 的雙鍵伸縮振動峰與水的H-O-H彎曲振動峰，并使得羧酸γ（C=O）的雙鍵振動峰右移至此處，1 257 cm-1處是γ（C=O）的單鍵振動峰，1 104 cm-1處尖銳的峰是γ（CN）（脂肪）的單鍵振動峰，613 cm-1是NH2的單鍵伸縮振動峰，2 923 cm-1處是-CH2-伸縮震動峰，1 458 cm-1處是CH 單鍵振動峰，與氨基酸的特征吸收峰一致，該物質為游離氨基酸的混合物，其分子式為R-CH（COOH）-NH2?nH2O。

圖3 氨基酸的紅外分析

3 結 論

本實驗以雞糞發酵液為原料，經過蛋白酶水解，雙水相萃取法提取氨基酸，并運用改進的茚三酮法對其進行定量檢測，結果表明蛋白酶與發酵液配比為1 g酶/10 mL 發酵液時，該雞糞發酵液最佳水解溫度為44℃，不同溫度下水解效率為η（44℃）>η（46℃）>η（42℃）。隨著水解時間延長，水解效率逐漸提高，氨基酸產率也隨之升高，隨后增長趨勢放緩；水解反應進行到48 h 后，氨基酸含量在44℃時達到133.04 mg/mL。因此，本實驗研發的雞糞發酵液中提取游離氨基酸的方法不僅能提高游離氨基酸含量，還可更好地保留其活性。