綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因變化的研究

肖 成，王 晶,2，薛佳佳,3，柳儉強(qiáng)，于永生，張立春，馬惠海，金海國(guó)*，曹 陽(yáng)*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000）

優(yōu)質(zhì)羊肉越來(lái)越受到消費(fèi)者的歡迎，而提高肌內(nèi)脂肪含量能夠提升羊肉品質(zhì)。遺傳因素是影響肌內(nèi)脂肪含量的重要因素之一，但參與調(diào)控綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的基因及通路錯(cuò)綜復(fù)雜。本文著重研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵基因在綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的變化規(guī)律。這為研究參與綿羊脂代謝并與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)的作用基因提供有價(jià)值的參考。Wnt 信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)個(gè)體生長(zhǎng)，參與機(jī)體多方面發(fā)育，是維持器官穩(wěn)態(tài)的著名信號(hào)通路。目前，科研人員研究Wnt/β-catenin 信號(hào)通路主要圍繞細(xì)胞增殖、腫瘤、疾病、神經(jīng)、繁殖等方面進(jìn)行[1]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 參與脂肪細(xì)胞分化，發(fā)揮重要作用[2]。目前，在人、小鼠、豬以及牛上關(guān)于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的研究較多[3]，但在綿羊上，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因如何變化仍沒(méi)有系統(tǒng)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，探索Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因在綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的變化規(guī)律，旨在為Wnt/β-catenin信號(hào)通路在綿羊脂代謝方面的研究提供有價(jià)值參考，為尋找與綿羊脂代謝相關(guān)的作用基因提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選擇2 月齡雄性綿羊1 只，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)研究所飼養(yǎng)。人道處死后，無(wú)菌取腹溝處白色脂肪組織，用于分離前體脂肪細(xì)胞。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 分離細(xì)胞所用胰酶、膠原酶II 來(lái)自Sigma 生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿來(lái)自Corning 公司；胎牛血清來(lái)自Gemini 生物公司；PBS 緩沖液、DMEM-F12培養(yǎng)基、雙抗來(lái)自賽默飛生物公司；細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑如（胰島素、地塞米松、IBMX）等均來(lái)自Sigma 公司；RNA 提取試劑TRIzol 來(lái)自Invitrogen 公司；PCR 預(yù)混酶來(lái)自康為世紀(jì)生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 Maker 購(gòu)自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及測(cè)序服務(wù)由蘇州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master 由羅氏（中國(guó)）公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 綿羊前體脂肪細(xì)胞分離 用含有1%雙抗的PBS 清洗干凈白色脂肪組織，無(wú)菌鑷子剔除脂肪組織中筋膜及血塊，手術(shù)剪刀將組織剪成1 mm3小塊。組織塊用膠原酶II 浸泡并置于37℃水浴鍋內(nèi)消化1 h，每5 min 混勻一次，消化后液體經(jīng)200 目及400 目濾網(wǎng)過(guò)濾出未消化的組織及雜細(xì)胞。1 500 r/min 轉(zhuǎn)離心15 min 棄上清。完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種到60 mm 培養(yǎng)皿中，細(xì)胞大約6 h 貼壁。12 h 換液，除掉雜細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞。細(xì)胞置于37℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每48 h 換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。第三代細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，胰島素、地塞米松以及IBMX混合培養(yǎng)液作為誘導(dǎo)I 液誘導(dǎo)細(xì)胞，48 h 換誘導(dǎo)II 液（含胰島素的完全培養(yǎng)基），48 h 后換完全培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5 d，油紅O 染色驗(yàn)證成熟的脂肪細(xì)胞。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證 根據(jù)Genbank 中提供的綿羊基因Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因序列以及內(nèi)參基因GAPDH序 列（NM_001190390.1），使 用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 引物序列（表1）。定量引物驗(yàn)證，使用普通PCR 方法檢測(cè)引物特異性。PCR 反應(yīng)體系20 μL：預(yù)混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8 μL；擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、退火溫度30 s、72℃延伸溫度30 s、35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，條帶單一引物可用于定量實(shí)驗(yàn)。

表1 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因引物序列

1.3.3 提取細(xì)胞分化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)RNA 前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程包含2 個(gè)階段，第一個(gè)階段是細(xì)胞增殖，當(dāng)細(xì)胞布滿培養(yǎng)皿后細(xì)胞進(jìn)入第二階段，即細(xì)胞分化。體外細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞需要誘導(dǎo)劑的參與。實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞整個(gè)分化過(guò)程中選擇4 個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)用于驗(yàn)證Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因變化規(guī)律。它們分別是：①細(xì)胞布滿培養(yǎng)皿時(shí)期，即細(xì)胞增殖期（第2天）；②細(xì)胞添加外源誘導(dǎo)I 液48 h 后，即細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入分化期（第4 天）；③細(xì)胞添加外源誘導(dǎo)II 液48 h后即細(xì)胞分化期中期（第6 天）；④細(xì)胞更換正常培養(yǎng)液48 h 后，即細(xì)胞分化期（第8 天）；采用TRIzol 試劑提取上述4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量PCR 采用羅氏480 儀器以及配套試劑，qRT-PCR 體系為20 μL：Light Cycler 480 SYBR GreenI Master（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95℃5 min，95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s、65℃ 1 min、40℃ 10 s，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。Roche Light Cycler 480 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPad Prism 軟件作圖，利用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平定為P<0.05，極顯著水平定為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 綿羊前體脂肪細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、分化 前體脂肪細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿后，顯微鏡下觀察細(xì)胞為呈球狀。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)其直徑大小約為10～30 μmol/L。細(xì)胞接種6 h 后開(kāi)始貼壁，其形態(tài)呈不規(guī)則梭形。12 h換液去除未貼壁細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入快速增殖階段。當(dāng)細(xì)胞布滿培養(yǎng)皿后出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。添加外源誘導(dǎo)劑，細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入分化階段。當(dāng)細(xì)胞分化一定階段后，內(nèi)部有脂滴生成，經(jīng)油紅O 染色，可以將脂滴染成紅色，驗(yàn)證脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成功（圖1）。

圖1 油紅O 染色脂肪細(xì)胞圖

2.2 提取細(xì)胞總RNA 并驗(yàn)證引物 實(shí)驗(yàn)選擇細(xì)胞分化過(guò)程的第2 天、第4 天、第6 天、第8 天，共4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以及分光光度計(jì)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RNA 純度以及濃度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖2 可知，引物特異性好，可以用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。

圖2 定量引物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以上述總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA 分別檢測(cè)Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin基因在脂肪分化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律。如圖3 所示，Wnt10b、Frizzled1、GSK3β、LRP5、LRP6基因表達(dá)量在第4 天顯著上升，然后出現(xiàn)顯著下降。Frizzled2基因在第4 天以及第8 天顯著下降。β-catenin基因只有在第8 天出現(xiàn)顯著上升。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)

3 討 論

Wnt 蛋白是含有350～400 個(gè)氨基酸的分泌型糖蛋白，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)有19 種Wnt 蛋白[4]。Wnt 蛋白調(diào)控多條信號(hào)通路，其中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路之一，最近有研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在脂肪細(xì)胞形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中β-catenin作為第二信使具有重要的調(diào)節(jié)功能[5-6]。有研究表明，在生理?xiàng)l件下Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是不活化的，保持較低的表達(dá)水平。細(xì)胞內(nèi)GSK3β基因不斷磷酸化導(dǎo)致β-catenin基因不能發(fā)揮作用[7]。當(dāng)外界信號(hào)刺激Wnt 蛋白，Wnt 活化轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上結(jié)合細(xì)胞表面特異性受體卷曲蛋白Frizzled 并與低密度脂蛋白LRP5/6形成復(fù)合體抑制GSK3β基因表達(dá)，解除GSK3β基因?qū)Ζ?catenin的限制。細(xì)胞內(nèi)的β-catenin不斷積累并進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合發(fā)揮作用[8-15]。有研究表明，Wnt10b基因在小鼠前體脂肪細(xì)胞增殖過(guò)程中高表達(dá)，添加成脂誘導(dǎo)劑后，其表達(dá)量減少，Wnt10b基因具有抑制脂肪細(xì)胞分化的能力[5,16]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵基因Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin。

在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Wnt10b、Frizzled1、GSK3β、LRP5、LRP6基因在第4 天顯著上升，然后顯著下降。Wnt10b、Frizzled1、LRP5、LRP6在綿羊細(xì)胞增殖融合時(shí)以及添加外源誘導(dǎo)I 液時(shí)顯著表達(dá)。隨著分化的進(jìn)行，其基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ross[5]的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明Wnt10b可能結(jié)合受體Frizzled1、LRP5、LRP6基因在綿羊脂肪細(xì)胞增殖過(guò)程高表達(dá)發(fā)揮作用，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制脂肪細(xì)胞分化。當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始分化時(shí)Wnt10b表達(dá)被減弱，其受體Frizzled1、LRP5、LRP6基因表達(dá)也開(kāi)始降低。稍有差別的是Wnt10b、Frizzled1、LRP5、LRP6、GSK3β基因只有在綿羊細(xì)胞快速增殖及添加誘導(dǎo)I 液時(shí)短時(shí)間高表達(dá)，這是與小鼠不同的地方。可能是因?yàn)樵诰d羊個(gè)體中Wnt其他成員參與此過(guò)程，表達(dá)時(shí)間不同。Frizzled2基因在第2 天以及第6 天顯著升高，在第4天以及第8 天顯著下降。可能是由于Frizzled2基因?qū)?xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用，但是隨著誘導(dǎo)I 液的加入，一些促進(jìn)細(xì)胞分化的因子開(kāi)始表達(dá)如PPARγ、C/EBPα，導(dǎo)致Frizzled2基因被抑制。這可能說(shuō)明在綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，F(xiàn)rizzled2基因不與Wnt10b基因結(jié)合，相反可能受其抑制。隨著Wnt10b基因表達(dá)量下降，F(xiàn)rizzled2基因表達(dá)量出現(xiàn)短暫上升，隨后由于具有抑制脂肪分化的功能，所以表達(dá)量又出現(xiàn)下降。β-catenin基因前6 天的趨勢(shì)與Wnt10b基因一致，只有在第8 天出現(xiàn)上升，可能是由于具有其他功能而導(dǎo)致的，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綿羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮重要作用。其中關(guān)鍵基因Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin均出現(xiàn)顯著變化。Wnt10b、GSK3β、Frizzled1、LRP5、LRP6基因在第4 天出現(xiàn)顯著升高，F(xiàn)rizzled2、β-catenin基因出現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。