不同尾型綿羊群體尾脂差異lncRNA 的表達驗證與功能預測

吐爾遜阿依·牙力坤，曹 行，王 瓊,2，劉玲玲，劉武軍*

（1.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.吐魯番職業技術學院，新疆吐魯番 838000）

脂肪不僅是一種重要的儲能物質，而且在調節動物體能量平衡過程中起著重要作用，并與動物產肉量、肉品質、肉風味等產肉性狀密切相關。尾脂肪也被人類用作食物。但是，由于日常飲食中過多的脂肪被認為對人體健康有害，而脂肪功能的紊亂可導致許多心血管疾病的發生，如高血脂、II 型糖尿病等，因此動物脂肪沉積的分子調控機制備受關注。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸，具有調控細胞增殖、分化、凋亡及自噬等多種生物學過程的非編碼RNA 分子[1]。動物脂肪沉積是一個復雜的生物過程，受功能基因、非編碼RNA 和成脂相關信號通路等系列遺傳因子的級聯調控，其中lncRNA 起重要的調控作用[2]。近年來，越來越多的研究發現mRNA 和lncRNA 在動物脂肪沉積中發揮重要作用。前人發現了幾種調控脂肪生成的lncRNA，例如3T3-L1 細胞中的lncRNANEAT1[3]和小鼠中的Blnc1[4]。在人類中，lncRNA ADINR 通過激活CCAAT 增強子結合蛋白α（C/EBPα）的轉錄來促進脂肪形成[5]。lncRNAH19 在骨髓間充質干細胞進入脂肪細胞的過程中抑制脂肪細胞的分化[6]。據報道，lncRNA MEG3 參與了人類脂肪干細胞在成脂和成骨分化之間的平衡[7]。最近，已經發現了幾種調節綿羊脂肪形成的lncRNA。

Mohammad 等[8]對伊朗大尾羊和小尾羊進行了轉錄組比較分析，研究了綿羊肥尾lncRNA 的表達及其在脂肪沉積中的可能作用，并鑒定了7 個大尾和小尾之間差異表達基因，通過lncRNA-mRNA 相互作用的基因調控網絡，發現了3 個與脂質代謝相關的重要模塊。Miao等[9]在綿羊中通過深度測序已經確定了心臟、皮膚、肌肉、乳腺和脂肪組織等的轉錄組譜，分析了小尾寒羊與多塞特羊之間皮下脂肪組織的轉錄組信息。Ma 等[10]為了評估蘭州大尾羊、小尾寒羊以及藏羊這些綿羊品種中與尾脂肪沉積和發育相關的lncRNA 和mRNA，對這3 個個體進行了高通量RNA 測序。通過3 組的RNA 測序數據顯示長尾巴的綿羊和細尾巴的綿羊組之間有10個差異表達的基因和37 個差異表達的lncRNA。差異表達基因和差異表達的lncRNA 的靶基因的基因本體論和途徑分析發現，脂肪酸代謝和與脂肪酸伸長有關的途徑均富集，這些途徑有助于脂肪沉積。

迄今為止，關于lncRNA 在綿羊脂肪沉積中的調控功能及其如何調節mRNA 表達的報道較少。本研究選擇新疆地方綿羊巴什拜羊和巴什拜羊與盤羊雜交二代作為研究對象，采集肥尾和小尾綿羊群體的尾部組織，利用全轉錄組技術，篩選出在尾脂中高表達的差異MSTRG.37980、MSTRG.38164，對其靶基因進行預測，并對該lncRNA 及其靶基因的表達規律進行分析，初步確定二者表達量及其在調控綿羊脂肪代謝中的作用，以期為鑒定與綿羊脂肪代謝調節機制相關的功能基因提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗樣品的采集 本次實驗所需的動物來自于新疆塔城裕民縣地區隨機挑選相同飼養條件下的10 月齡的6 只巴什拜羊及6 只野生盤羊×巴什拜羊的雜交二代羊，公母各3 只，屠宰后立即采集尾脂、皮下脂、背最長肌、股四頭肌、臂三頭肌、肝臟、瘤胃、十二指腸、盲腸、大腸、小腸共11 種組織，并將采集好的新鮮組織裝入2 mL RNase-Free 凍存管，暫存于液氮中，帶回實驗室后將全部樣品迅速轉移至-80℃冰箱保存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 差異表達lncRNA 的選擇 前期對6 只巴什拜羊和6 只野生盤羊× 巴什拜羊的雜交二代羊的尾脂組織中的RNA-seq 結果共檢測到了728 個差異表達的lncRNA；進行差異lncRNA 的靶基因預測后進行靶基因的功能富集分析，發現MSTRG.37980 的靶基因SCD（硬脂酰輔酶A 去飽和酶）參與PPAR 信號通路，MSTRG.38164 的靶基因GPAM（線粒體甘油-3-磷酸?；D移酶）與脂肪部位脂肪沉積有關。

1.3 RNA 的提取 將肌肉組織樣從液氮中拿出放入（取樣品約100 mg）提前預冷好的研缽中進行磨碎，使用Trizol 法進行總RNA 的提取，取2 μL 總RNA 利用1%的瓊脂糖凝膠進行完整性檢驗。

1.4 RNA 濃度的檢測 在Nanodrop 分光光度儀檢測孔內加入1 μL 的RNA 原液進行RNA 濃度檢測，分別記錄不同樣品的濃度和OD260/280的數值。其中D260nm/D260nm=1.8～2.0 的樣本可用于后續實驗，于-80℃保存待用。

1.5 引物設計及合成并PCR 擴增檢測

1.5.1 引物的設計 從2 種群體尾脂中差異表達篩選獲得的2 個lncRNA，根據測序結果中提供的序列設計引物，SCD基因（GenBank 登錄號：NM_001009254.1）和GPAM基因（GenBank 登錄號：XM_012102928.3）mRNA 序列從NCBI 數據庫中獲得，利用Primer 5.0 軟件設計引物，其中以β-actin（ID：HM067830.1）作為內參基因。引物名稱和序列、退火溫度以及擴增片段大小見表1。

表1 熒光定量引物信息

1.5.2 cDNA 的合成 使用上一步提取的總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書進行反轉錄，取出后的cDNA 在-20℃冷凍保存。

以上一步反轉錄獲得的cDNA 作為模板，進行目的基因的PCR 擴增（總體系為20 μL）：2×PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（0.2 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 1.5 μL（100 ng），ddH2O 7.7 μL。擴增程序為：94℃5 min；94℃ 30 s；54℃ 30 s，39 個循環；72℃ 5 min。PCR 產物取3 μL 與2 μL 6×Loading Buffer 混勻，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，180 V 20 min；使用凝膠成像系統采集圖像，若獲得的產物片段大小與預期一致則進行下一步實驗。

1.5.3 實時熒光定量PCR 熒光定量檢測采用7500 Fast Real-Time PCR System 型熒光定量PCR 儀進行，使用TB Green Premix Ex Taq II 的反應體系進行擴增（總體系為20 μL）：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，RNase-freeddH2O 6 μL，上、下游引物各0.8 μL，Rox Reference Dye II 0.4 μL，cDNA 2 μL，具體實驗操作流程按照產品說明書進行。每個樣品基因表達以β-actin基因作為內參基因，每個樣品重復檢測3 次。PCR 程序為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，54℃ 30 s，40 個循環。

1.6 統計分析 采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。運用SPSS 19.0 軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）進行組間比較，并用最小顯著差異法（Least Significant Difference，LSD）進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總RNA 的檢測 圖1 可明顯看到28S 和18S 條帶，5S 條帶不明顯，說明提取的總RNA 完整性好且無降解；利用核酸檢測儀進行總RNA 濃度測定，提取的總RNA濃度高且無蛋白質、DNA 等污染，可用于后續實驗。

圖1 總RNA 電泳圖

2.2 PCR 產物檢測 利用2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物（圖2），發現產物片段大小均符合預期，有且僅有1 條帶，說明引物設計的特異性良好，前期RNA 提取及cDNA 的反轉錄符合要求。

圖2 目的基因的qRT-PCR 檢測

2.3 lncRNA 表達量與RNA-Seq 結果比較 選取綿羊尾脂樣品，將挑選出的lncRNA 的qRT-PCR 結果與前期RNA-Seq 結果進行比較，結果表明：MSTRG.37980 與MSTRG.38164 在巴什拜羊與雜交二代羊尾部脂肪組織中的定量和RNA-Seq 結果基本一致，表明RNA-Seq 結果較為準確可靠，可用于后續實驗。

2.4 巴什拜羊和雜交二代羊不同組織中MSTRG.37980的表達差異分析 由圖3 可以看出，MSTRG.37980 在巴什拜羊尾脂和小腸中的表達量極顯著高于雜交二代羊，在背最長肌中的表達量顯著高于雜交二代羊，在皮下脂、臂三頭肌、股四頭肌、十二指腸、盲腸中的表達量均高于雜交二代羊，但差異不顯著。

圖3 MSTRG.37980 在巴什拜羊與雜交二代羊不同組織中的相對表達差異

2.5 巴什拜羊和雜交二代羊不同組織中SCD基因的表達差異分析 由圖4 可以看出，SCD基因在巴什拜羊尾脂中表達量極顯著高于雜交二代羊，在皮下脂、背最長肌、臂三頭肌、股四頭肌、十二指腸、盲腸、小腸部位的表達量高于雜交二代羊，但差異不顯著；雜交二代羊大腸中表達量顯著高于巴什拜羊，肝臟、瘤胃中的表達量高于巴什拜羊，但差異不顯著。

圖4 SCD 基因在巴什拜羊與雜交二代羊不同組織中的相對表達差異

2.6 巴什拜羊和雜交二代羊不同組織中的MSTRG.38164表達差異分析 由圖5 可知，MSTRG.38164 在巴什拜羊尾脂中表達量極顯著高于雜交二代羊，背最長肌和肝臟中表達量顯著高于雜交二代羊，且皮下脂、臂三頭肌、股四頭肌、十二指腸、盲腸、大腸、小腸中的表達量均高于雜交二代羊，差異不顯著；雜交二代羊瘤胃中的表達量高于巴什拜羊。

圖5 MSTRG.38164 在巴什拜羊與雜交二代羊不同組織中的相對表達差異

2.7 巴什拜羊和雜交二代羊不同組織中GPAM基因的表達差異分析 由圖6 可以看出，GPAM基因在巴什拜羊肝臟中表達量顯著高于雜交二代羊；雜交二代羊瘤胃中的表達量高于巴什拜羊，但差異不顯著，其他部位表達量均低于巴什拜羊。

圖6 GPAM 基因在巴什拜羊與雜交二代羊不同組織中的相對表達差異

3 討 論

3.1 MSTRG.37980 與SCD基因在巴什拜羊和雜交二代羊各組織表達量的比較分析SCD是在脂肪生物合成中將飽和脂肪酸（SFA）轉換為單不飽和脂肪酸（MUFA）的關鍵酶[11-12]，它具有調節動物體內脂代謝的功能。前人研究發現，哺乳動物中，SCD主要在肝臟、肌肉組織、脂肪組織中高表達[13]，可作為肌內脂肪沉積的潛在生物標志物[14]。而本研究發現SCD基因的mRNA 在巴什拜羊皮下脂肪表達量最高，雜交二代羊大腸、肝臟表達量最高，與前人研究一致，在組織中的表達量情況基本相同，但SCD基因在巴什拜羊與二代羊各組織中的表達規律有一定差異。Huang 等[15]在萊蕪豬和大白豬皮下脂肪組織中鑒定出了與脂代謝和成脂分化相關的lncRNA 和基因，表明了lncRNA 可以靶向mRNA，然后在PPAR 信號傳導通路、脂肪細胞分化和脂肪酸代謝中發揮重要的作用，并鑒定了SCD基因參與PPAR 信號通路。本實驗結果推測SCD基因通過參與PPAR 信號通路，參加脂肪合成相關基因的表達，使得巴什拜羊形成大尾。Ma 等[10]人通過綿羊尾部脂肪組織中的差異表達基因和lncRNA 進行網絡構建，共得到了493 對共表達對，并發現這些共表達的對中，大部分是顯著正相關，只有一小部分對是負相關，表明了這些mRNA和lncRNA 可能主要通過正向調控發揮作用。本實驗結果MSTRG.37980 和SCD基因的mRNA 在巴什拜羊和雜交二代羊各組織部位的表達規律基本相似，說明MSTRG.37980 可能參與脂肪沉積，并且可能通過正向調控作用使SCD基因的mRNA 表達高。

3.2 MSTRG.38164 與GPAM基因在巴什拜羊和雜交二代羊各組織表達量的比較分析GPAM基因的主要作用是通過催化三酰基甘油和磷脂生物合成過程，從而促進動物機體甘油三酯（TAG）的生成，并通過中心和外周調節作用，對哺乳動物脂肪沉積、能量消耗、胴體質量以及整體的代謝進行調控[16-17]。于海濱[18]為了驗證GPAM基因對脂代謝的影響，通過脂質體介導牛GPAM基因的RNA 干擾載體，沉默內源，抑制GPAM表達后顯著降低牛前體脂肪細胞和牛胎兒成纖維細胞中的甘油三酯含量，證明了GPAM基因可能在調節動物脂肪代謝中起關鍵作用。并且有學者發現，GPAM基因在所有脂肪中都有所表達，其中在肝臟、脂肪組織中表達量最高，其次是肌肉[19]。而本實驗發現GPAM基因在肌肉、脂肪以及肝臟部位的表達量較高，與該研究結果基本一致，推測出GPAM可能調控脂肪合成。本實驗對比了GPAM基因在巴什拜羊與二代羊相同部位的表達差異發現，該基因在2 種羊肝臟部位的表達差異顯著。由此推測，GPAM基因在巴什拜羊中可能主要在肝臟、脂肪部位發生作用，從而增加脂肪的沉積。本實驗還發現GPAM基因和MSTRG.38164 在巴什拜羊和雜交二代羊各部位的表達規律是相似的，MSTRG.38164 可能通過對GPAM的調控，參與脂肪合成并沉積。以上研究結果表明，MSTRG.38164 和GPAM基因功能可能是廣泛的，尤其是在脂肪沉積方面。

4 結 論

本研究利用qRT-PCR 對2 種差異表達lncRNA 靶基因進行了表達量分析，發現MSTRG.37980 和MSTRG.3定量與RNA-Seq 結果相似；SCD基因和MSTRG.37980在巴什拜羊和雜交二代羊各組織部位表達規律基本相似，并且SCD基因通過參與PPAR 信號通路，參加脂肪合成相關基因的表達，使得巴什拜羊形成大尾，MSTRG.37980 可能參與脂肪沉積，并通過正向調控作用使SCD基因的mRNA 表達高；GPAM基因和MSTRG.38164 在巴什拜羊和雜交二代羊各部位的表達規律相似，GPAM基因可能在巴什拜羊肝臟、脂肪部位發生作用，使得脂肪沉積增加。MSTRG.38164 可能通過對GPAM的調控參與脂肪合成并沉積。