基于多工具的山羊circRNA-miRNA靶向關(guān)系分析

陶 虎，楊 娟，許銘洙，劉澤林，張 年，劉 洋，陳明新*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010）

CircRNA 是一類以共價(jià)鍵首尾連接成環(huán)的非編碼RNA 分子，在結(jié)構(gòu)上不包含5'端帽子和3' poly A 尾。自1976 首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，circRNA 一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，并無(wú)生物學(xué)功能[1]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，大量circRNA 在各類生物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，研究人員也逐漸揭示了circRNA 在各種生命過(guò)程中發(fā)揮的重要調(diào)控作用。CircRNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有很高的穩(wěn)定性，可以作為各類癌癥的標(biāo)志物[2]；Piwecka 等人[3]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA Cdr1as 能調(diào)控哺乳動(dòng)物大腦中的miRNA 水平，缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)神經(jīng)元異常和行為障礙；山羊中新發(fā)現(xiàn)的circ_ZCCHC24 可以促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞的增殖[4]。CircRNA 主要有4 種作用機(jī)制：1）競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA，調(diào)控其靶基因的表達(dá)[5]；2）調(diào)節(jié)RNA 結(jié)合蛋白，可作為蛋白分子的海綿體[6]；3）與RNA 聚合酶II 相互作用，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[7]；4）編碼蛋白質(zhì)發(fā)揮功能[8]。本研究前期以高低繁殖力的麻城黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，分析高低產(chǎn)羔數(shù)山羊排卵前卵泡中circRNA 的表達(dá)情況，篩選出差異表達(dá)的circ_0008219 作為調(diào)控山羊卵泡發(fā)育的候選因子，擬下一步開(kāi)展深入研究[9]。

MiRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具眾多，在動(dòng)物中常用的工具包括miRWalk[10]、PicTar[11]、miRanda[12]、Targetscan[13]、RNAhybrid[14]、PITA[15]、miRmap[16]、DIANA-microT[17]和RNA22V2[18]等，但這些工具主要針對(duì)人、小鼠等熱點(diǎn)物種開(kāi)發(fā)，其中一些預(yù)測(cè)工具參數(shù)設(shè)置有限或無(wú)法輸入序列，只能通過(guò)已有數(shù)據(jù)庫(kù)中選取相應(yīng)ID 進(jìn)行分析，這對(duì)于山羊一類家畜則無(wú)法進(jìn)行靶向關(guān)系的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。

本研究選擇5 款支持輸入序列分析的本地化miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具（miRanda、targetscan、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2）來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用山羊circ_0008219 全長(zhǎng)序列和山羊所有miRNA 種子序列信息進(jìn)行二者靶向關(guān)系的聯(lián)合預(yù)測(cè)。通過(guò)對(duì)上述結(jié)果取交集，獲得了10 個(gè)潛在的候選miRNA，選取其中5 個(gè)8mer site 類型進(jìn)行后續(xù)研究。利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-130b-5p、miR-423-3p、miR-326-3p 和miR-671-5p 可與載體靶序列結(jié)合。本研究表明利用支持序列分析的多工具對(duì)miRNA 靶標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)，具有較高的陽(yáng)性率，可為circRNA 與miRNA 靶向關(guān)系預(yù)測(cè)提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種羊場(chǎng)選擇12 月齡的成年母羊，采集血液樣品置于抗凝采血管中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品利用基因組DNA 提取試劑盒（天根公司）進(jìn)行提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 聚合酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase購(gòu)自中國(guó)的寶生物工程（大連）有限公司。Ecos感受態(tài)細(xì)胞和pmirGLO 雙熒光表達(dá)載體由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；pMD18-T Vector 購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶PmeI 和NheI、T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB 公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System 購(gòu) 自Promega 公 司；miRNA mimics 和NC 由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成；山羊皮膚成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)；引物序列由北京奧科生物科技公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 軟件的下載與安裝 miRanda v3.3a、targetscan 7.2、RNAhybrid 2.1.2、PITA 1.6 和RNA22 V2 5 款miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具均安裝于linux 系統(tǒng)中。

1）miRanda

miRanda 的下載地址：http://cbio.mskcc.org/micror na_data/miRanda-aug2010.tar.gz

miRanda 的安裝命令如下：

tar -xzvf miRanda-aug2010.tar.gz

cd/path/to/miRanda-3.3a4

./configure --prefix=/path/to/miRandada-aug2010

sudo make

sudo make install

2）Targetscan

Targetscan 的下載地址：http://www.targetscan.org/vert_72/vert_72_data_download/targetscan_70.zip

Targetscan 的安裝命令如下：

unzip targetscan_70.zip

cd/path/to/targetscan_70

perl targetscan_70.pl

其中，targetscan_70.pl 為perl 腳本文件，可在perl 語(yǔ)言環(huán)境下運(yùn)行。

3）RNAhybrid

RNAhybrid 的下載地址：https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/applications/rnahybrid/resources/downloads/RNAhybrid-2.1.2.tar.gz

RNAhybrid 的安裝命令如下：

tar -xzvf RNAhybrid-2.1.2.tar.gz

cd/path/to/RNAhybrid-2.1.2

./configure

sudo make

sudo make install

4）PITA

PITA 的下載地址：http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/64bit_exe_pita_prediction.tar.gz

PITA 的安裝命令如下：

tar -zxvf 64bit_exe_pita_prediction.tar.gz

cd/path/to/ 64bit_exe_pita_prediction

./configure

sudo make

sudo make install

5）RNA22V2

RNA22V2 的下載地址：https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/remoteRNA22v2.zip

RNA22V2 的安裝命令如下：

unzip remoteRNA22v2.zip

cd/path/to/remoteRNA22v2

java RNA22v2

將miRNA 種子序列和circ_0008219 全長(zhǎng)序列文件導(dǎo)入Parameters.properties 和RNA22v2.class 所在文件夾中，打開(kāi)Parameters.properties 文件，根據(jù)注釋信息修改后運(yùn)行程序。

1.3.2 原始數(shù)據(jù)整理 數(shù)據(jù)均儲(chǔ)存于txt 文檔內(nèi)，miRanda、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2 4 款工具所需數(shù)據(jù)為FASTA 格式，包括2 個(gè)文件：山羊所有miRNA 種子序列文件和circ_0008219 全長(zhǎng)序列文件。其中，山羊miRNA 的種子序列文件可從miRbase 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載，下載網(wǎng)址為ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa.gz。Targetscan 工具的數(shù)據(jù)格式有別于其他軟件，miRNA 序列格式為“miRNAID 種子序列物種ID”，circ_0008219 的全長(zhǎng)序列格式為“基因ID 物種ID 序列。”

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 在linux 系統(tǒng)中，運(yùn)行安裝好的5 款工具，對(duì)miRNA 的種子序列文件和circ_0008219 的全長(zhǎng)序列文件進(jìn)行處理。程序運(yùn)行方法如下：

1）miRanda 程序運(yùn)行命令如下：

miranda -sc 140 -en -7 miRNA.txt circ_0008219.txt-out miRanda_result.txt

其中，-sc 指分?jǐn)?shù)閾值，-en 指能量閾值。

2）Targetscan 程序運(yùn)行命令如下：

Perl targetscan_50.pl miRNA.txt circ_0008219.txt targetscan_result.txt

3）RNAhybrid 程序運(yùn)行命令如下：

RNAhybrid -s 3utr_human -t circ_0008219.txt -q miRNA.txt

4）PITA 程序運(yùn)行命令如下：

perl pita_prediction.pl -utr circ_0008219.txt -mir miRNA.txt -prefix PITA_result

5）RNA22V2 程序運(yùn)行命令如下：

java RNA22v2

上述5 款工具所得結(jié)果在Excel 2019 中進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，然后利用Calculate and draw custom Venn diagrams工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制韋恩圖、取交集。

1.3.4 載體構(gòu)建 根據(jù)circ_0008219 的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)合成包含PmeI 和NheI 酶切位點(diǎn)的引物對(duì)Full-PF、Full-PR（表1）。以山羊DNA 為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度為2 045 bp。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，58℃變性10 s，72℃變性20 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；16℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，利用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段。pmirGLO 質(zhì)粒經(jīng)雙酶切線性化后切膠回收。上述2 種膠回收產(chǎn)物利用T4 連接酶16℃連接2 h。連接體系加入50 μLEcos感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基（氨芐）上，于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。篩選陽(yáng)性克隆送北京奧科生物科技公司測(cè)序驗(yàn)證，提取重組載體質(zhì)粒備用。

表1 引物與探針信息

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 山羊皮膚成纖維細(xì)胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存，細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12 中加入10% 的胎牛血清，培養(yǎng)箱設(shè)置為5%CO2、37℃。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%的融合度，使用胰酶消化后均勻接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加入2 μL 的lipofectmin 3000、0.2 μL mimics 和1/20 μgpmir-8219 雙熒光載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于細(xì)胞，24 h 后提取蛋白，利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System 在多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)相對(duì)熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 與circRNA 靶向結(jié)合的miRNA 預(yù)測(cè) 利用miRanda、targetscan、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2 等5 款miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具來(lái)進(jìn)行山羊circ_0008219 序列中miRNA 靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRanda 有68 個(gè)miRNA 結(jié)合，targetscan 有308 個(gè)，RNAhybrid 有47 個(gè)，PITA 有174 個(gè)，RNA22V2 有333 個(gè)，上述結(jié)果取交集后，共得到10 個(gè)miRNA 與circ_0008219 結(jié)合（圖1A），13 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)信息（圖1B）。

圖1 circ_0008219 與miRNA 互作結(jié)果

如表2 所示，預(yù)測(cè)結(jié)果中包含8mer site 和7mer-m8 site 2 種匹配類型，屬于8mer site 類型的有：miR-423-3p、miR-330-5p、miR-326-3p、miR-671-5p 和miR-130b-5p。屬于7mer-m8 site 類型的有：miR-485-5p、miR-483、miR-330-5p、miR-326-3p、miR-130b-5p、let-7g-3p、miR-1343 和miR-29b-5p。此外，miR-330-5p、miR-326-3p 和miR-130b-5p 同時(shí)具有8mer site 和7mer-m8 site 2 種匹配類型。8mer site 的特異性高，假陽(yáng)性率低于7mer-m8。

表2 miRNA 匹配類型

2.2 山羊circ_0008219 雙熒光素酶載體構(gòu)建 為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的circRNA-miRNA 的靶向關(guān)系，利用酶切重組法構(gòu)建了circ_0008219 的pmirGLO 雙熒光素酶重組載體。利用PCR 擴(kuò)增circ_0008219 的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為2 045 bp。凝膠電泳結(jié)果顯示，片段長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果相符，無(wú)雜帶（圖2）。

圖2 山羊circ_0008219 基因全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增

山羊circ_0008219 全長(zhǎng)序列的PCR 回收產(chǎn)物和雙熒光素酶載體pmirGLO 質(zhì)粒（圖3）經(jīng)PmeI 和NheI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。利用T4 連接酶連接線性化pmirGLO 質(zhì)粒和circ_0008219 序列的雙酶切回收產(chǎn)物，隨后克隆轉(zhuǎn)化入Ecos感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。將陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果表明，目的片段與模板序列完全一致，該載體質(zhì)粒命名為pmir-8219。

圖3 雙熒光素酶載體pmirGLO 的模式圖

2.3 候選miRNA 的驗(yàn)證 選取8mer site 匹配類型的miR-423-3p、miR-330-5p、miR-326-3p、miR-671-5p和miR-130b-5p 等5 個(gè)miRNA，合成mimics 和NC，與pmir-8219 載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于山羊皮膚成纖維細(xì)胞，檢測(cè)pmir-8219 質(zhì)粒的熒光活性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-130b-5p 可以抑制pmir-8219 質(zhì)粒的熒光活性（P<0.01），miR-423-3p、miR-326-3p 和miR-671-5p 則發(fā)揮抑制作用（P<0.05）（圖4）。結(jié)果表明，circ_0008219 可以通過(guò)“分子海綿”作用吸附miR-130b-5p、miR-326-3p、miR-671-5p 和miR-423-3p，從而發(fā)揮調(diào)控作用。此外，也證明了利用5 款miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)有較高的陽(yáng)性率。

圖4 候選miRNA 對(duì)pmir-8219 雙熒光素酶載體熒光活性的調(diào)控

3 討 論

近年來(lái)，非編碼RNA 已成為各類生命活動(dòng)中基因表達(dá)調(diào)控的明星因子，在疾病、生長(zhǎng)發(fā)育等領(lǐng)域已有大量重要研究成果相繼被報(bào)道[19]。CircRNA 作為ncRNA的重要成員之一，在山羊研究領(lǐng)域中僅在乳腺上皮細(xì)胞增殖[20]、子宮內(nèi)膜容受[21]、骨骼肌發(fā)育[22]等方面有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究前期以高繁殖力的麻城黑山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，分析高低產(chǎn)羔數(shù)山羊排卵前卵泡中circRNA的表達(dá)情況，篩選出差異表達(dá)的circ_0008219 作為候選因子擬開(kāi)展深入研究[9]。

CircRNA 通過(guò)吸附miRNA 發(fā)揮調(diào)控作用是其最重要的作用形式之一。利用miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析是研究的關(guān)鍵步驟。現(xiàn)有的miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具有數(shù)十種之多，分為離線型和在線型[23]。預(yù)測(cè)工具主要通過(guò)4 個(gè)方面信息來(lái)進(jìn)行miRNA 的靶基因預(yù)測(cè)：1）miRNA 與靶基因之間的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系；2）靶基因的熱力學(xué)穩(wěn)定性；3）靶基因的物種保守性特征；4）機(jī)器學(xué)習(xí)方法[24]。但這些預(yù)測(cè)工具大多針對(duì)人、小鼠等物種開(kāi)發(fā)，仍存在無(wú)法輸入已知序列、參數(shù)設(shè)置較為有限、只能輸入miRNA 和靶基因ID 等問(wèn)題，這都導(dǎo)致了在進(jìn)行家畜miRNA 研究過(guò)程中，只能以人或小鼠的基因來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如果同源性不高，將導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。

CircRNA 最常見(jiàn)的調(diào)控機(jī)制——“miRNA 分子海綿”需要進(jìn)行互作位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。CircRNA 與miRNA 互作關(guān)系預(yù)測(cè)仍然遵循miRNA 種子序列中5'端2-7nt 與circRNA 序列形成Watson-Crick 配對(duì)這一重要原則。根據(jù)上述配對(duì)的匹配情況可分為以下形式：1）8mer site：miRNA 第2-8 nt 與circRNA 序列完全配對(duì)，circRNA 序列對(duì)應(yīng)miRNA 第1 nt 為A；2）7mer-m8 site：miRNA第2～8 nt 與circRNA 序列完全配對(duì)；3）7mer-1A site：miRNA 第2～7 nt 與circRNA 序列完全配對(duì)，circRNA序列對(duì)應(yīng)miRNA 第1 nt 為A；4）6mer site：miRNA 第2～7 nt 與circRNA 序列完全配對(duì)[25]。匹配類型的特異性為：8mer site>7mer-m8 site>7mer-1A site>6mer site。在分析預(yù)測(cè)結(jié)果時(shí)，盡量選擇8mer site 類型，以提高實(shí)驗(yàn)成功率。

CircRNA 與miRNA 互補(bǔ)配對(duì)的緊密程度直接影響其作用機(jī)制。Cdr1as 是在哺乳動(dòng)物大腦中高表達(dá)的一種circRNA，可吸附miR-7 發(fā)揮重要作用[26]。隨后，Piwecka 等人[3]發(fā)現(xiàn)Cdr1as 可以結(jié)合另一種miR-671，且miR-7 下調(diào)表達(dá)，miR-671 上調(diào)表達(dá)。Cdr1as與miR-7 不是完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致Cdr1as 與miR-7 結(jié)合后不會(huì)被Ago2 蛋白剪切降解，起到穩(wěn)定miR-7 的作用；Cdr1as 與miR-671 完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致Cdr1as與miR-671 結(jié)合后被Ago2 蛋白剪切降解，無(wú)法發(fā)揮吸附作用。該研究揭示了circRNA 作為ceRNA 作用的新機(jī)制，提示研究者在選擇與circRNA 靶向作用的miRNA 時(shí)，需要考慮結(jié)合的緊密程度，根據(jù)circRNA和miRNA 的表達(dá)情況，明確circRNA 的作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究選擇了miRanda、targetscan、RNAhybrid、PITA 和RNA22V2 等5 款支持輸入序列分析的本地化miRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具來(lái)進(jìn)行山羊circ_0008219 序列中miRNA 靶向關(guān)系的聯(lián)合預(yù)測(cè)，共得到10 個(gè)候選miRNA，13 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)信息。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選擇了結(jié)合類型為8mer 的5 個(gè)miRNA，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-130b-5p、miR-423-3p、miR-326-3p 和miR-671-5p 可與載體靶序列結(jié)合。本研究表明利用支持序列分析的多工具進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)miRNA 靶位點(diǎn)具有較好的陽(yáng)性率，為circRNA 與miRNA 靶向關(guān)系預(yù)測(cè)提供了新的思路和方法。