細胞自噬在雄性繁殖生理中的研究進展

魏冬芹，吳 德，林 燕

（四川農業大學動物營養研究所，四川成都 611130）

細胞自噬（Autophagy）是存在于所有真核生物的基本過程，其主要功能是分解代謝不需要的成分以提供能量和必需的物質。自噬參與雄性生殖系統內多種細胞的生命進程，并涉及雄性生殖系統中許多疾病的關鍵病理生理過程，如無精子癥、少精子癥、弱精子癥、隱睪癥和睪丸炎等[1]。在雄性動物睪丸微環境中，細胞自噬可以保護睪丸細胞的存活或加速部分細胞凋亡[2]。在精子發生過程中，細胞自噬參與了二倍體生殖細胞的誘導，同時參與精子形成過程中精子細胞的分化，以確保形成精子正常的鞭毛和頂體結構[3]。自噬和睪丸激素生物合成之間的聯系也直接影響著睪丸的內分泌調節[4]。此外，細胞自噬調控支持細胞外質特化（Ectoplasmic Specialization，ES）的完整性，而ES 是血液-睪屏障（Blood-Testis Barrier，BTB）的基礎結構[5]，調控著精子發生。因此細胞自噬在睪丸功能中的參與受到廣泛關注，但目前關于自噬在雄性生殖系統中的研究工作并不系統。本文綜述了細胞自噬在雄性繁殖生理領域的研究進展，總結了睪丸的生精細胞、間質細胞和支持細胞中自噬引發的調節作用及其分子機制，為研究雄性生殖中細胞自噬提供參考。

1 細胞自噬的簡介

細胞自噬是指細胞內受損、變性或衰老的蛋白質和細胞器被運輸到溶酶體，溶酶體對其消化降解，以胞質內自噬體的出現為標志的細胞自我消化過程。以雙層膜結構包裹部分胞質和細胞器的自噬體為判斷指標。根據細胞內底物運送到溶酶體腔方式的不同，哺乳動物細胞自噬分為巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侶介導自噬（Chaperonemediated autophagy）3 種主要方式，其中巨自噬是主要的自噬形式。本文中除特殊說明外，所講的自噬均指巨自噬。

自噬體的基本結構首先由Porter 等[6]揭示，其在大鼠肝細胞中觀察到自噬體。隨后，研究人員在許多其他細胞類型中也觀察到自噬體，這表明自噬是真核生物中普遍存在的機制。自噬作用被認為是在營養供給減少和其他外部干擾下細胞平衡代謝穩態的結果。細胞自噬誘導了胞內內源儲備的快速動員，以生成三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）作為能量合成的來源[7]。因此，自噬的形成降低了細胞對營養缺乏的敏感性。在腫瘤細胞系中，自噬作為抗逆微環境的普遍現象，比正常細胞更常見。此外，自噬對于正常細胞的存活是必不可少的，并且基礎自噬的維持對于生理學上的許多細胞類型的存活和功能至關重要，尤其是神經細胞[8]。自噬的異常與許多疾病有關，如衰老、癌癥、心臟病和肥胖[9]。

2 自噬對雄性生殖的生理作用

精子發生是一種高度調節的生物過程，而自噬已被證明是睪丸中精子發生和類固醇產生的重要調節因素。自噬在睪丸不同類型細胞中的不同生理作用見表1。

表1 自噬在睪丸不同類型細胞中的不同生理作用

2.1 自噬在精子發生中的作用 雄性動物睪丸主要由兩部分組成，一部分是間質細胞，其主要分泌雄激素，調節精子發生；另一部分是生精小管，是精子產生的主要場所。而生精小管又由支持細胞和各級生殖細胞組成，支持細胞主要發揮對生殖細胞的支持、營養作用，決定生殖細胞數量。

哺乳動物正常的精子發生過程分為3 個不同階段：有絲分裂期，未分化的精原細胞經歷快速增殖；減數分裂階段，精母細胞通過2 次細胞分裂產生單倍體精子細胞；精子形成期，精子細胞經歷形態和功能分化的復雜過程，并導致成熟精子的產生。在此過程中生殖細胞經歷了幾次結構重組，包括頂體的產生、核染色質的凝聚、線粒體的重排、精子鞭毛的組裝以及去除不必要的細胞質到功能性精子的產生[21]。一些研究已經證明了自噬參與了二倍體生殖細胞的誘導，同時參與精子形成過程中精子細胞的分化[10-11]。

2.1.1 二倍體生殖細胞的自噬 哺乳動物睪丸二倍體生殖細胞包括精原細胞和精原干細胞（Spermatogonial Stem Cells，SSCs），其通過重復的有絲分裂和減數分裂形成單倍體精子細胞。在此過程中將經歷染色體結構重組和細胞減數分裂過程，確保高分化精子可成功釋放到小管腔。但值得注意的是，正常生理條件下SSCs 的自噬水平相對低于睪丸中其他類型的生殖細胞，如在正常生理條件下的圓形和伸長的精子細胞[22]。此外，自噬不參與SSCs 的出生后發育，在精原細胞（7 d）和精母細胞（15 d）階段沒有自噬[22]。在組織學上，SSCs 細胞數量很少，在嚙齒動物睪丸中僅占所有生殖細胞的0.03%[23]。在造血干細胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）上研究表明，自噬的發生對于HSCs 維持是必不可少的，并且自噬的喪失導致線粒體中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）和DNA 損傷的積累[24]。而與HSCs 類似，SSCs 同樣具有相識的特征。精子發生過程中細胞分裂的高速率意味著精原細胞中線粒體氧消耗和ROS 產生的水平相應升高[3]。然而，沒有關于自噬在精原細胞中自我調節作用的研究。因此，SSCs 中細胞基礎自噬的維持也可能是一種自我保護機制，在其分化和自我更新過程中與HSCs 類似。另一方面，ROS 通過啟動不同的下游信號傳導途徑參與細胞自噬的誘導[10-11]。在小鼠睪丸生殖細胞中已經報道了高濃度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）在精原細胞的抗氧化防御中起關鍵作用[10]。在精原細胞中，GSH 消耗導致自噬的誘導。但GSH 的消耗不會影響ROS 水平，其導致S-谷胱甘肽化蛋白質下調，從而導致精原細胞中自噬的誘導，研究表明GSH 耗竭通過獨立于腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate-activated Protein Kinase，AMPK）的信號通路啟動自噬[25]。這些證據表明氧化應激可能是通過控制精原細胞中S-谷胱甘肽化蛋白水平來影響精原細胞在生理上轉向自噬。由GSH 耗竭誘導的自噬激活不會導致精原細胞中能量狀態的改變。

2.1.2 精子細胞分化中的自噬 實際上，與二倍體生殖細胞相比，細長精子細胞中自噬相關蛋白（如LC3 和Atg7）的表達顯著更高[13]。通過生殖細胞特異性敲除Atg7 消除自噬后，導致睪丸重量減少，精子畸形，顯著降低雄性小鼠的生育能力[26]。精子發生是一種復雜且高度有序的細胞分化過程，需要重組細胞結構和重新調節細胞生理功能。成功去除細胞質被認為對于功能性精子的產生至關重要。精子的功能障礙主要是由精子頭部或其鞭毛的異常引起。自噬與精子形成過程密切相關，自噬的缺失將導致精子頭部和尾部異常[12]。

在精子中，頂體是位于精子核前部的特殊膜性細胞器，這對于卵丘細胞的分散和受精過程中卵母細胞透明帶反應至關重要。頂體的形成涉及細胞骨架的重編程，其需要誘導自噬以輔助細胞骨架的重排。頂體的形成分為高爾基體期、頭帽期、頂體期和成熟期4 個階段[12]。自噬參與從高爾基體階段開始的頂體形成過程。在高爾基體期，正常條件下高爾基體衍生的前囊泡融合到精子細胞核中，形成靠近細胞核一端的單個頂體囊泡。但在自噬基因Atg7敲除后，高爾基體精子細胞的多個小囊泡不能彼此融合，從而顯示出多個頂體囊泡結構。在頭帽期，來自高爾基體的多頂體囊泡或聚集體的積累將導致頂體的收縮，致使頂體畸形[13]。這些證據表明，頂體畸形很可能是由于前頂體囊泡未能正常融合而未能被轉移到細胞核一端的前體內導致的。從機制上講，Atg7在頂體生物發生中的功能可能與其在自噬誘導中的作用相關。在自噬發生中，LC3 主要參與自噬囊泡脂質融合。在精子細胞中，LC3 僅與反式高爾基體網絡標記（Trans-Golgi Network 38，TGN38）共定位而不是頂體制造者（Sperm Protein 56，SP56）。因此，膜相關LC3 可能參與高爾基體衍生的前囊泡的囊泡融合及其向頂體的轉運。在Atg7敲除后，LC3 未能與TGN38 共定位，導致在高爾基體附近的凹陷區域中前囊泡的囊泡積聚[12]。最后，這種積聚損害了后期階段頂體體積的增加，從而導致頂體形成缺陷。

研究表明，除了自噬對頂體形成的作用外，它還通過線粒體的重排和消除不必要的細胞質參與精子鞭毛的形成，以促進精子的運動。PDZ 和LIM 結構域蛋白1（PDZ and LIM domain protein 1，PDLIM1）是PDZ和LIM 蛋白家族的成員，含有N 末端PDZ 結構域和C末端LIM 結構域。PDLIM1 可以將其他蛋白質帶入細胞骨架折疊[3]。在精子發生過程中，PDLIM1 作為自噬和細胞骨架組織之間的介質起作用。在正常條件下，需要通過自噬-溶酶體途徑降解PDLIM1 以維持細胞骨架網絡的適當動態，從而確保精子細胞分化可以順利處理。自噬的破壞導致自噬體吞噬PDLIM1 失敗，從而導致它們在細胞質中積累。PDLIM1 的積累破壞了細胞骨架的正常動態，并且在精子形成過程中導致細胞質的無效去除，使精子細胞的細胞骨架成分解體[14]，從而導致精子中的鞭毛結構破壞。精子鞭毛結構的正常對于精子的正常運動至關重要，因此自噬能夠顯著改變精子活動參數，包括平均路徑速度（Average Path Velocity，VAP）、直線速度（Straight Line Velocity，VSL）和曲線速度（Curvilinear Velocity，VCL）。

2.2 自噬在睪丸體細胞中的功能 支持細胞和間質細胞是哺乳動物睪丸中存在的2 種體細胞，2 種類型的睪丸體細胞都采用自噬作為維持細胞穩態的調節機制。

2.2.1 自噬在支持細胞中的作用 在精子發生過程中，分化的生殖細胞經歷從圓形精子細胞到精子的連續形態轉化，這需要精子細胞的細胞重塑和支持細胞的輔助。支持細胞參與曲細精管內許多無用成分的降解，如精子細胞殘留體和凋亡生殖細胞。支持細胞具有代謝這些物質的顯著能力。自噬與吞噬作用過程有關，并且與支持細胞中進入的外部底物的降解相關。比如將培養的支持細胞暴露于異源的（例如由其他組織產生的外部區段）或同源的底物（例如通過分化生殖細胞產生的殘余體），2 種底物類型都被吞噬作用攝取[17]。然而，自噬選擇性地參與支持細胞中那些異源的降解，并且抑制自噬顯著延緩了異源底物的降解[17]。

支持細胞ES 和精子細胞的頂體復合物是2 種細胞骨架結構，在精子頭的成形中起重要作用[5]。其中，ES 由2 個組成部分組成，即血液-睪丸屏障中相鄰支持細胞之間基于肌動蛋白的非典型黏附連接，稱為基底ES，而支持細胞和生精小管腔表面的精子細胞之間的連接被稱為頂端ES。基礎ES 功能是成為BTB，頂端ES 與輔助精子細胞頭的成形、精子細胞的運動和成熟精子的釋放有關[20]。而研究已經證明，自噬基因Atg7或Atg5敲除導致的自噬缺失干擾了生精上皮中頂端ES和基底ES 的組裝[1]。機理上的研究表明，與精子細胞頂體形成相似，自噬破壞會損害支持細胞PDLIM1 的降解，從而導致其在支持細胞中的積累[3,18]。因此，支持細胞中細胞骨架的組織受到干擾，ES 結構的破壞最終導致支持細胞-生殖細胞通訊的破壞，從而導致精子頭畸形。

ABP 是一種由睪丸支持細胞合成和分泌的蛋白。生精小管中的精子發生過程和附睪中精子的成熟過程都需要高濃度的ABP。在哺乳動物中，ABP 的產生和分泌受促卵泡素、雌二醇和睪酮的調節[1,27]。在支持細胞中，睪酮通過自噬參與ABP 的合成和分泌。體外研究表明ABP 與原代大鼠支持細胞中的LC3 共定位，抑制或刺激自噬顯著改變支持細胞中ABP 的表達模式和水平而不影響ABP mRNA 的表達，這意味著自噬對ABP合成分泌具有調節作用[19]。自噬參與的ABP 的降解僅對其蛋白質水平起作用。此外，睪酮對自噬的抑制作用也受睪酮濃度的影響，睪酮濃度增加也進一步抑制自噬的發生[19-20]。

2.2.2 自噬在間質細胞中的作用 前人的研究揭示了自噬在類固醇生成和分泌中的調節作用。在雄性哺乳動物中，睪丸中睪酮占總循環睪酮的95% 左右，而間質細胞是哺乳動物睪丸中的主要睪酮貢獻者。與許多其他類型產生類固醇的細胞一樣，間質細胞通常比其他細胞類型擁有更大的線粒體。類固醇的生產是直接與線粒體功能的損害有關。在其他細胞類型中已經報道了自噬在細胞線粒體降解中的作用[4]。間質細胞中自噬的頻率高于許多其他類型的細胞，如在大鼠間質細胞中也觀察到豐富的自噬體吞噬細胞器的現象，封閉在自噬泡中的大多數細胞器是線粒體，即參與雄激素產生的細胞器[28]。這些證據表明自噬活動可能與調節間質細胞中雄激素分泌有關。研究表明，自噬過程與大鼠間質細胞中睪酮產生高度相關，自噬的缺乏通常與睪丸穩態的失調有關[15]。用自噬抑制劑和自噬激活劑分別處理不同日齡大鼠的間質細胞，發現用自噬抑制劑處理的大鼠的間質細胞類固醇生成急性調節蛋白（Steroid Acute Regulatory Protein，StAR）表達和睪酮產生都減少，細胞內ROS水平增加；相比之下用自噬激活劑處理，只增強了來自老年大鼠間質細胞中的類固醇生成，細胞內ROS 水平減少；然而敲除自噬基因Beclin 1的老年大鼠間質細胞中StAR 表達和睪酮產生減少，細胞內ROS 水平增加[16]。這些結果表明自噬缺陷與老年大鼠間質細胞的類固醇生成下降有關，可能受細胞內ROS 水平影響。因此，自噬過程與大鼠間質細胞中睪酮的產生高度相關。

3 自噬調節雄性生殖的重要信號通路

自噬是一種對周圍環境極為敏感的生命現象，與能量的調控及營養物質的循環更新密切相關。通過自噬途徑對細胞內受損、變性或衰老的大分子物質及細胞器進行降解，降解產生的多種基本營養元素（如氨基酸、核苷酸等）及 ATP 等可參與到細胞的新陳代謝過程中，從而實現營養物質再循環及能量的補充。葡萄糖、氨基酸作為機體的營養素具有密切調控自噬的作用。機體能量參與的調控自噬的最重要信號通路是AMPK-mTORULKl/2，而氨基酸主要通過mTORC1 和GCN2 途徑調控自噬。

3.1 AMPK-mTOR-ULKl/2 信號通路 AMPK 是一種在進化過程中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶[29]。AMPK的活性受體內AMP 水平的影響，AMP 能夠與AMPK的γ亞基結合，通過調節 AMPK 構象促進α亞基活性結構域中Thrl72 位點磷酸化，從而激活AMPK。由此，AMPK 被認為是一種“細胞能量感受器”，在調節能量穩態中發揮著重要作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是細胞代謝的中心調節樞紐，mTOR 可以和不同的蛋白組分形成2 個在結構和功能上均很不同的復合物（mTORC1 和mTORC2）[30]。其中，mTORC1 參與抑制細胞自噬的調節。研究發現，mTORC1 抑制自噬主要通過2 個方面作用：一方面，轉錄因子能夠促進溶酶體生物合成，mTORCl 通過負向調節轉錄因子抑制溶酶體合成，進而抑制自噬；另外一方面，mTORC1 還能夠通過作用于Unc-51-樣 激1（UNC-51-like kinase 1，ULKl）和Unc-51-樣激酶2（UNC-51-like kinase 2，ULK2）的蛋白復合物抑制自噬作用[31]，其主要參與自噬的啟動階段調節。

AMPK、mTOR、ULKl/2 復合物對自噬的調控機制：在能量充足的條件下，mTORCl 通過磷酸化ULKl/2 的Ser757 位點抑制ULKl/2 激酶復合物功能，從而導致自噬的抑制[32]。當細胞能量不足時，ULKl/2 中mTORCl依賴性的磷酸化位點迅速發生去磷酸化，從而誘導自噬發生。ULKl/2 的mTORCl 依賴性的磷酸化位點去磷酸化通過2 種方式：①自磷酸化并對 Atg13 和FIP200進行磷酸化；②AMPK 磷酸化 ULKl/2 中的Ser317 和Ser777 位點，從而被激活。另外，AMPK 還能夠通過磷酸化mTORCl 中的raptor 蛋白從而抑制mTORC1活性，直接導致自噬的發生。同時AMPK、mTOR 以及ULKl/2 復合物在調控自噬的過程中存在負反饋調控機制。一方面，mTORCl 和AMPK 能夠通過直接活化ULKl/2 復合物調控其功能從而對自噬產生影響；另一方面，ULKI/2 復合物能夠通過磷酸化raptor 調節mTORCl 功能，也能夠通過磷酸化AMPK 的3 個亞基調節AMPK 功能[33-34]。

3.2 mTORC1、GCN2/eIF2 信號通路 自噬是細胞中蛋白質降解的重要途徑之一，當氨基酸代謝庫中氨基酸含量發生變化時，自噬活動會隨之受到影響[35]。如仔豬早期斷奶后1～2 d，血漿中必需氨基酸濃度降低，機體自噬程度明顯升高[36]。可見氨基酸和自噬是相互依賴的。氨基酸主要通過膳食攝入獲得，并通過質膜跨膜轉運蛋白轉運到細胞中。游離的胞內氨基酸不僅作為代謝物和能量的來源，而且直接有助于嚴格調控2 條途徑，即級聯整合合成代謝和分解代謝的mTORC1 和真核起始因子2（General Control Non-derepressible 2/eukaryotic Initiation Factor 2，GCN2/eIF2）信號通路[37]。這些通路通過調節蛋白質翻譯，并伴隨調節自噬依賴性分解代謝來控制細胞對氨基酸的需求。

當細胞中氨基酸充足時，細胞將抑制自噬發生，這主要是mTORC1 通過磷酸化ULKl/2 的Ser757 位點來抑制ULK1/2 激酶復合物誘導的自噬。當氨基酸饑餓時，滅活mTORC1 導致這種含有ULK1 的促自噬性復合物的激活，其促進信號級聯以正向調節自噬體的形成，延伸，成熟并最終降解蛋白質。細胞內氨基酸濃度也受另一種絲氨酸/蘇氨酸激酶GCN2 調節。被激活的該酶會磷酸化elF2a 的Ser-51 位點，進而降低eIF2 在招募蛋氨酰起始子tRNA 到40S 核糖體亞基方面的功能。由此總的蛋白質翻譯受到抑制。研究發現氨基酸缺乏誘導的GCN2/eIF2a 路徑激活還可以啟動自噬基因轉錄，從而啟動自噬過程而增加胞質中的氨基酸含量[38-39]。GCN2 信號路徑激活可以直接啟動一些自噬基因轉錄，如Atgl6、Mapllc3b、Atgl2、Atg93、Becn1 及Gabarapl2，也可以協同CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/ enhancerbinding Protein Homologous Protein，CHOP）完成對一些自噬基因的轉錄啟動，如p62/Sqstml、Nbrl 和Atg97[40]。啟動的自噬可以通過循環利用氨基酸來補充細胞內氨基酸的不足。因此，GCN2 激活旨在促進恢復細胞內氨基酸水平。

4 營養通過自噬調節雄性生殖

自噬是一個進化上高度保守的細胞過程，起始于對細胞組分糖原、脂質、可溶性蛋白、核糖體和細胞器的吞噬，隨后開始酶解，生成糖、脂質、氨基酸和核苷等基礎營養素，接著排出到細胞質中。這些由自噬產生的營養素可以參與到細胞器更新過程中及維持能量水平、蛋白質合成和關鍵代謝過程中，從而實現營養物質再循環及能量的補充[32,34-35]。所以自噬和營養是密不可分的。Pang 等[41]給羔羊能量限制喂養2 個月，然后再補充喂養3 個月，結果表明，飼喂30% 能量限制飼料的羔羊中的睪丸重量和在生精小管中的精子細胞數量顯著降低，但對照組和15%能量限制組之間沒有差異。同時，15%和30%能量限制飲食通過激活AMPK-ULK1 信號通路誘導睪丸自噬和凋亡，上調了Beclin-1、LC3-II 和LC3-I 比例，以及激活AMPK，磷酸化AMPK（p-AMPK）和ULK1。此外，當在能量限制后以正常能量需求重新喂養羔羊時，這些參數得到補償。Zhang 等[42]研究發現，亮氨酸可提高斑馬魚睪丸P62 和LC3-II 的表達，將帶熒光標簽的LC3 載體轉染到HepG2 細胞中發現 LC3 和溶酶體標記物共定位，但亮氨酸的處理抑制了自噬的發生。Zhang 等的研究結果表明，短期用亮氨酸治療可以通過影響自噬和抑制自噬體和溶酶體的融合來增加斑馬魚的精子活力。

5 結論與展望

現有數據表明自噬與睪丸穩態的調節密切相關，如自噬在調節生殖細胞的存活、精子細胞的轉化、支持細胞的重排和間質細胞的睪酮產生中發揮作用。同時營養可以通過AMPK-mTOR-ULKl/2、mTORC1 和GCN2等信號通路調控自噬的發生，但對營養通過自噬發生調節雄性生殖能力的研究較少，但營養介導自噬和自噬相關蛋白在生精細胞中起著促進生殖的作用，并通過直接抑制精原細胞-精母細胞-精子細胞的凋亡來促進ES完整性。因此，通過營養調節自噬的發生將是養殖生產中促進雄性生殖的新方向。