環狀RNA 的生物學功能及其對動物腸道屏障功能作用的研究進展

魏文焯，鄭 超，劉靜波，皮勁松，張 昊*

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010）

1976 年，Sanger 等[1]在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中發現類病毒Viroids 可侵染馬鈴薯植株并導致植株死亡，但與病毒不同的是，其不具備蛋白質外殼，且基因組是單鏈、閉合的RNA。1979 年，洛克菲勒大學Hsu和Coca-Prados 研究員在電子顯微鏡下觀察到真核細胞細胞質中circ RNA 的存在，隨后在小鼠、大鼠及果蠅中陸續發現類似結構的分子[2-4]，但受對ncRNA 的認知水平和技術手段限制，當時僅認為它是RNA 錯誤剪切的副產物[5]。隨著高通量RNA 測序技術、生物信息學技術和基因功能研究的不斷發展，人們逐漸發現circ RNA 在機體內發揮著重要作用。2012 年，Salzman 等[6]利用轉錄組測序技術發現circ RNA 在人類細胞中廣泛存在，引發學術界對circ RNA 的研究熱度不斷提升，目前已經成為分子生物學領域的研究熱點。

本文綜述了circ RNA 的分類、形成機制、生物學功能及circ RNA 成環的影響因素，并對近幾年來在動物腸道屏障功能方面的研究進展進行歸納與總結，以期為動物腸道屏障功能方面的研究提供參考，并對circ RNA 的研究進行展望。

1 circ RNA 的生物學特征

1.1 circ RNA 的結構與分類 circ RNA 是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA 分子[7-8]。在反向剪接過程中，下游5'端剪接位點與上游3' 端剪接位點反向連接，在連接位點形成一個具有3'，5'磷酸二酯鍵的circ RNA 分子[9-10]。circ RNA 與傳統線性RNA 不同，circ RNA 以環狀形式存在，其3' 頭端和5' 尾端以共價鍵連接而成，使其避免被RNA 核酸外切酶和脫支酶降解，是其表達穩定，不易降解的重要原因[11-12]。Circ RNA 根據來源可分為三大類[13-15]：①外顯子來源的circ RNA（exonic circ RNA，ecirc RNA），ecirc RNA 是由一個或多個外顯子首尾拼接而成，其占circ RNA 的絕大多數（超過80%）[16]；②外顯子-內含子來源的circ RNA（exon-intron circ RNA，EIcirc RNA），EIcirc RNA 由編碼基因的外顯子序列和內含子序列組成，不同于僅由外顯子序列組成的特異RNA[17]；③內含子來源的circ RNA（circular intronic RNA，ciRNA），ciRNA 廣泛存在于細胞核中，由內含子自身環化形成[10]。

1.2 circ RNA 的環化方式 近年來研究表明，circ RNA的環化方式主要有4 種（圖1），分別是套索驅動環化、內含子配對驅動環化、RNA 結合蛋白（RBP）驅動環化及ciRNA 的環化[10-11,18]。

圖1 circ RNA 形成示意圖[22]

套索驅動環化又稱為外顯子跳躍，即上游5' 剪接供體位點與下游3' 剪接受體位點結合，產生含有內含子和外顯子的套索，然后通過反向剪接去除套索中的內含子序列，產生circ RNA，剩余部分形成mRNA。

內含子配對驅動環化又稱為直接反向剪接，側翼內含子的反向互補序列堿基互補配對形成一個環狀結構（如Alu 序列），內含子序列隨后經前體RNA（premRNA）剪接生成circ RNA。

RNA 結合蛋白（RBP）驅動環化，近年來，有研究發現RBP 如RNA 特異性腺苷脫氨酶1（Adenosine Deaminase Acting on RNA1，ADAR1）和細胞核核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，hnRNP L）與circ RNA 的生成有重要聯系，RBP 可通過與側翼內含子結合使供體位點與受體位點的距離縮短，從而促進外顯子的環化[19-20]。

ciRNA 的環化，由靠近5' 端剪切位點的一段長度為7 nt 的含有GU 堿基序列和3' 端分支位點的一段長度為11 nt 的含有C 堿基序列共有基序，以2'，5'-磷酸二酯鍵使首尾相連形成，ci-ankrd52 是具有代表性的ciRNA[21]。

1.3 circ RNA 的功能

1.3.1 充當miRNA 海綿 miRNA 是一種由內源基因編碼的長度在18～25 nt 的非編碼RNA，可以通過與mRNA的5'和3'端非編碼區（UTRs）結合，使目標mRNA 降解，在動植物中參與轉錄后基因表達調控作用[23-24]。Circ RNA 可以依靠自身的miRNA 結合位點來吸附特定的miRNA，從而減少miRNA 與靶基因的結合，影響miRNA 對mRNA 的轉錄后調控[25]。第一個被發現并確認的miRNA 海綿是ciRS-7，它由小腦退化相關蛋白1（CDR1as）產生[26-28]。ciRS-7/CDR1as 包括70 多個miR-7 結合位點，當CDR1as 表達升高時，miR-7 的表達降低，實現miR-7 的有效吸附，削弱miR-7 對靶mRNA的調控作用，致使miR-7的靶基因表達升高[26,29-31]。有研究發現，ciRS-7 上調或miR-7 敲除會損害斑馬魚中腦的發育[29]。同源結構域相互作用蛋白激酶3（Homeodomain-Interacting Protein Kinases-3，HIPK3）基因來源的circ RNA 稱之為circ HIPK3，可與miR-124 結合，抑制miR-124 活性[32]。同時，circ HIPK3可吸附miR-558，并通過其靶向mRNA 抑制膀胱癌細胞肝素酶的表達[33]。此外，circ MTO1 能夠通過吸附促癌miR-9，促進肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（p21）表達，抑制HCC 增殖，提示circ MTO1 是治療HCC 的一個潛在靶點[34]。總之，circ RNA 在疾病過程中起重要調控作用，可為疾病的檢測及治療提供新思路。

1.3.2 與蛋白質的相互作用 circ RNA 可與蛋白質相互作用，參與基因的表達調控。正常情況下，細胞周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin Dependent Kinase 2，CDK2）與細胞周期蛋白結合推動細胞周期進程，而circ-Foxo3可與CDK2、p21 結合形成circ-Foxo3-p21-CDK2 三元復合物，阻礙CDK2 的功能，從而阻滯了細胞周期運行[35-36]。Abdelmohsen 等[37]研究發現，circ PABPN1可抑制RNA 結合蛋白HUR 與核內poly(A)結合蛋白1（PABPN1）mRNA 的結合，降低PABPN1 mRNA 表達水平。此外，有研究發現盲肌蛋白（Muscleblind，MBL）的表達與circ MBL 有密切聯系，當MBL 表達升高，circ MBL 表達增加，若MBL 表達降低，增加的circ MBL 會與MBL 結合下調其表達，控制MBL 表達水平[38]。

1.3.3 參與蛋白質合成 目前有研究表明，若circ RNA 含有內部核糖體進入位點序列（Internal Ribosome Entry Site，IRES）或開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），通過滾動循環擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）翻譯為有生物活性多肽或蛋白質[39-41]。例如，肌肉組織中的circ-ZNF609 包含一個753nt 的ORF，可以被翻譯為肌細胞分化調節蛋白[42]。此外，circ 0041407 結構中包含了IRES，可以翻譯為嵌合蛋白[43]。

1.3.4 調控基因的轉錄 此外，circ RNA 還具有調控基因轉錄等功能：在人體細胞中，ciRNA（例如ciankrd52）累積在細胞核內，通過與RNA 聚合酶II（Pol II）相互作用，可作為Pol II 轉錄的正調控因子順式調控其親本基因轉錄[10]。EIcirc RNA 在細胞核內與U1 snRNP 相互作用，并促進親本基因轉錄[44]。隨著circ RNA 研究的不斷深入，更多的生物學功能被逐漸闡釋。

2 circ RNA 成環的影響因素

2.1 剪接體成分 剪接體是參與RNA 剪接的大分子復合物，由5 種小的細胞核RNA（small nuclear RNA，snRNA）和170 多個蛋白動態組裝而成[45]。剪接體的組成及活性對circ RNA 合成有重要影響，有研究表明，抑制核心剪接體（如SF3b/SF3a 復合體）活性可促進pre-mRNA 反向剪接，剪接體成分缺失可導致circ RNA表達水平上升，但影響的大小主要取決于減少的成分和circ RNA 的種類[46-47]。例如，剪接體中snRNP-U1-70K或snRNP-U1-C 缺失可使PlexA 和pasilla（ps）circ RNA 水平增加10 倍，但對Laccase2、Uex、minibrain（mnb）和CG42663 circ RNA 表達影響較小。

2.2 Pol II 的轉錄伸長率 Circ RNA 的形成依賴于剪接機制，Pol II 轉錄伸長率（Pol II Transcription Elongation Rates，Pol II TER）可影響剪接體組裝和特異性序列的剪接調控位點。有研究發現，當Pol II 分別攜帶能減速或加速轉錄的突變體R749H 或E1126G 轉染入細胞時，circ RNA 成環效率與Pol II TER 呈正相關，即Pol II TER 升高時，circ RNA 成環效率較高，反之則低[48]。此外，Liang 等[46]研究發現，抑制Pol II 的轉錄終止會促進circ RNA 形成，表明Pol II TER 升高會促進circ RNA 合成。

2.3 剪接因子 剪接因子是一種參與RNA 前體剪接過程的蛋白質因子，對circ RNA 形成起重要作用，剪接因子可與側翼內含子結合，加速circ RNA 反向剪接。有研究表明，可變剪切因子Quaking（QKI）在上皮細胞向間質細胞轉化過程中可促進circ RNA 合成[18]。Yu 等[49]研究發現，剪接因子ESRP1 在人類胚胎干細胞中促進circ BIRC6 合成。同時，在乳腺癌中，剪接因子ESRP1促進circ ANKS1B 合成[50]。此外，剪接因子ESRP1 通過與側翼內含子結合促進circ UHRF1 環化，形成反饋循環，加速口腔鱗狀細胞癌發生[51]。可見，剪接因子在circ RNA 形成過程中扮演著重要角色。

2.4 轉錄速率 有研究發現，在RNA 合成過程中，轉錄速率會影響RNA 的折疊方式，正常轉錄過程中，RNA多采用順序折疊，按照轉錄順序進行堿基配對；若轉錄速率加快，則發生更多非順序折疊，遠端互補序列之間進行的堿基配對增加[52]。而在套索驅動環化過程中，pre-mRNA 在轉錄過程中發生非順序折疊，這提示circ RNA 形成可能與轉錄速度有關。

3 circ RNA 在動物腸道屏障功能作用上的研究進展

隨著研究的不斷深入，人們揭示了一部分circ RNA 的生物學功能，發現其可能參與人類癌癥等疾病的調控過程。與人相比，circ RNA 在動物方面的研究較少，本節對目前動物研究中，與動物腸道屏障相關的circ RNA 研究進展進行總結。

3.1 circ RNA 與腸道機械屏障 circ RNA 參與腸道損傷過程，在腸道疾病發展中起重要作用[53]。近期有研究發現，circ Pan3 可促進腸干細胞自我更新[54]。在克羅恩病中，有學者發現患者結腸黏膜組織中存在著218 個差異表達的circ RNA[55]。Yuan 等[56]在潰瘍性結腸炎癌變模型AOM/DSS 小鼠結腸組織中發現有234 個circ RNA 差異表達，提示circ RNA 可能在腸道炎癥中發揮重要作用。Wang 等[57]研究表明，circ-SOD2 可能通過與封閉蛋白8（CLDN-8）結合或吸附相關miRNA 的方式影響黏膜屏障功能，介導潰瘍性結腸炎發生。Ma等[58]研究發現，ssc-circ-009380 能在傳染性腸胃炎病毒（TGEV）感染期間吸附miR-22，激活NF-κB 通路誘導炎癥反應。此外，Liu 等[59]在敗血癥大鼠腸黏膜組織中發現circ-0001105 表達顯著下調，而上調circ-0001105 表達后發現，腸黏膜通透性、腸道炎癥反應及氧化損傷程度均顯著降低。綜上所述，circ RNA 可通過miRNA“海綿”作用或與目標蛋白質結合，調控腸道黏膜通透性或介導腸道炎癥發生。

3.2 circ RNA 與腸道生物屏障 腸道內微生物菌群構成機體腸道的微生物屏障。正常情況下，腸道微生態處于平衡狀態，抵抗病原菌的黏附、定植和入侵，而腸道微生物穩態打破會造成各種疾病發生，影響機體健康。此外，腸道菌群可通過調控circ RNA 表達，來影響機體某些功能。有研究發現，腸道菌群改變可抑制小鼠體內mmu-circ-0000730 表達，提高mmu-miR-466i-3p 及mmu-miR-466f-3p 表 達[60]。Zhang 等[61]研究發現，NLRP3 KO 小鼠腸道中擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度與circ HIPK2 水平呈負相關，而厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度與circ HIPK2 水平呈正相關，進一步試驗發現，糞便微生物移植抑制NLRP3 KO 小鼠體內circ HIPK2 表達，從而調節大腦星形膠質細胞功能障礙。此外，機體circ RNA 的表達也可影響腸道菌群的組成。Chen 等[62]研究表明，腸道微生物組成可影響某些circ RNA 在大腦中的表達，反向試驗證明，某些circ RNA 在大腦中過表達也可影響腸道菌群組成及其后代遺傳，與對照組相比，circ NF1-419 在大腦中過表達會導致SAMP8 小鼠腸道菌群中擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria）相對豐度增加，使擬桿菌屬（Bacteroides）及乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度發生改變。這些研究強調腸道菌群組成可影響動物機體內某些circ RNA 表達，進而影響機體某些生物學功能。上述研究證明了circ RNA 和腸道微生物之間的關聯，同時為以后的相關研究提供參考。

3.3 circ RNA 與腸道免疫化學屏障 腸道免疫屏障由腸黏膜淋巴組織和腸道內漿細胞分泌型抗體（S-IgA）構成，它們通過細胞免疫和體液免疫作用防止致病性抗原對肌體的傷害。circ RNA 與腸道免疫屏障有著緊密聯系，Liu 等[59]在敗血癥大鼠腸道中發現上調circ-0001105的表達可降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）和白細胞介素6（IL-6）的生成。固有淋巴細胞3（ILC3）是腸內免疫、炎癥和組織穩態的重要調節因子，而circ Kcnt2 表達下調會導致小鼠腸道內ILC3激活和結腸炎的發生[63]。此外，Liu 等[64]在敗血癥大鼠腸道中發現，沉默circ DNMT3B 可顯著提高白細胞介素10（IL-10）和IL-6 的水平，circ DNMT3B 被鑒定為miR-20b-5p 的靶基因，而在加入miR-20b-5p 抑制劑后IL-10、IL-6 的水平顯著下調。綜上所述，circ RNA 可通過影響腸道免疫因子的水平，進而影響腸道免疫屏障。

4 展 望

目前，人們對circ RNA 的研究還處在初始階段，在其形成、調控和功能等方面還有許多未解之謎。隨著新的研究手段的應用，目前已經證明，生物體細胞中擁有很多不同種類的circ RNA，盡管絕大多數circ RNA的調控機制和功能尚不清楚，但人們已經開始探索它們的功能和作用機制。在動物腸道健康方面，目前有關circ RNA 的研究還比較少，鑒于circ RNA 在調控基因表達及蛋白合成中的重要作用，深入開展有關動物腸道健康相關circ RNA 的篩選與功能研究，可以更好地配合國家無抗養殖策略，提供保護畜禽腸道健康新靶點，同時，也為揭示動物腸道損傷及其發生機制提供新思路。