家畜精子凍干保存技術(shù)研究進(jìn)展

于 洋，房曉歡，李俊杰,2*，王志剛,2*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

精子凍干保存（Freeze-Drying，F(xiàn)D）是指利用真空冷凍干燥，使精子處于失水干燥狀態(tài)保存于室溫或低溫環(huán)境的一種技術(shù)，雖然凍干保存處理后的精子失去活力，但仍具有受精能力，這對(duì)于拯救瀕危物種具有重要意義[1-2]，甚至某些物種已經(jīng)用凍干保存精子建立起精子庫(kù)。生物體未經(jīng)干燥而保存在室溫中是不穩(wěn)定的，會(huì)受到微生物的降解甚至發(fā)生變性，而無(wú)水生物除了能抵抗干燥的不利環(huán)境外，還可承受冷凍、高溫、有機(jī)溶劑和電離輻射的影響。凍干保存精子可在室溫下儲(chǔ)存[3]，且小鼠凍干保存后的精子核可耐受-196～150℃極端溫度以及空間站上強(qiáng)烈的陽(yáng)光輻射[4-5]。因此，凍干保存精子對(duì)于外界環(huán)境有很強(qiáng)的耐受性。此外，與超低溫保存相比，精子凍干保存不需要經(jīng)常補(bǔ)充液氮，并且室溫儲(chǔ)存成本低廉，便于運(yùn)輸，但其加工時(shí)間長(zhǎng)、能耗高和投資成本高等缺點(diǎn)，尤其是凍干保存精子會(huì)因快速冷凍和強(qiáng)力干燥而破壞精子膜，使其失去活力，尚不能應(yīng)用于人工授精和試管嬰兒，但其DNA 可被完整保留，因此可利用胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）技術(shù)將精子注射到卵母細(xì)胞中以獲得后代。但凍干保存精子的DNA極易斷裂，這成為制約該技術(shù)發(fā)展的重要瓶頸之一[6]。本文通過(guò)對(duì)精子凍干保存技術(shù)的原理、程序等進(jìn)行綜述，以期為精子的長(zhǎng)期保存提供依據(jù)。

1 精子凍干保存技術(shù)的發(fā)展

通過(guò)凍干保存技術(shù)將細(xì)胞保存于干燥狀態(tài)具有廣闊的應(yīng)用前景。最初凍干保存保存的樣品主要是細(xì)菌、病毒和其他微生物，1998 年Wakayama 等[7]首次報(bào)道利用小鼠凍干保存精子進(jìn)行ICSI 并獲得后代。表1 總結(jié)了一些哺乳動(dòng)物的FD 精子的研究結(jié)果。

表1 不同哺乳動(dòng)物的凍干精子研究結(jié)果

2 凍干保存技術(shù)原理

凍干保存技術(shù)包括冷凍和干燥兩個(gè)過(guò)程，即先將混合好的精液和凍干保存保存液冷凍，然后進(jìn)行升華（初次干燥）和解吸（二次干燥），最終將溶劑減少到無(wú)法支持生物生長(zhǎng)或產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。冷凍主要是分離溶劑和溶質(zhì)，溶劑會(huì)形成冰晶，而溶質(zhì)將被限制在冰晶間的空隙內(nèi)。干燥過(guò)程可通過(guò)冰的升華來(lái)實(shí)現(xiàn)[23]，其目的是將水充分去除，以便使樣品不發(fā)生化學(xué)或生物反應(yīng)而長(zhǎng)期保存。在初次干燥過(guò)程中，冷凍干燥機(jī)的壓力降低，溫度升高，從而使樣品中的冰晶升華，隨著升華進(jìn)行，樣品中的冰-氣界面逐漸消退，當(dāng)所有的冰晶從樣品中升華后，初次干燥完成。但此時(shí)樣品表面仍會(huì)吸附一定的水分，可通過(guò)二次干燥提高樣品溫度和降低水蒸氣分壓來(lái)完成剩余水的最終解吸。

3 凍干保存精子的制作工藝

凍干保存精子的制作工藝主要包括精子樣品制備、凍干保存試劑處理、冷凍干燥、樣品貯存[24]。

3.1 精子凍干保存保存的關(guān)鍵試劑 凍干保存試劑一般為均勻穩(wěn)定的鹽溶液，具有適宜的滲透壓和pH，易于干燥，可提供穩(wěn)定的再水化環(huán)境。目前，最簡(jiǎn)單的穩(wěn)定維持精子生育能力的方法是向凍干保存溶液中加入10 mmol/L Tris 和1 mmol/L EDTA，并且所需溶液pH 為8.0[25]。精子凍干保存的關(guān)鍵試劑主要有胎牛血清、核酸內(nèi)切酶抑制劑、海藻糖、迷迭香酸等。

胎牛血清含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的豐富營(yíng)養(yǎng)成分，是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基。在小鼠[7]、馬[21]和牛[17,26]等動(dòng)物上均證實(shí)，凍干保存溶液中添加胎牛血清（FCS）有助于提高凍干保存精子成功率，且濃度以10%為宜。

核酸內(nèi)切酶抑制劑可抑制DNA 降解，對(duì)于凍干保存精子DNA 完整性具有重要作用。2001 年，Kusakabe等[27]研發(fā)了一種含EGTA（可抑制內(nèi)切酶活性）的凍干保存精子試劑，隨后Kaneko 等[9]用同樣具有內(nèi)切酶活性的EDTA（乙二胺四乙酸）取代 EGTA，并證實(shí)添加少量 EDTA 有利于保持小鼠精子染色體完整性和受精能力。兔[28]和豬[29]的凍干保存精子研究證實(shí)，EDTA的效果優(yōu)于EGTA。但對(duì)馬[30]和狗[31]的凍干保存精子DNA 完整性的檢測(cè)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，EGTA 相比于EDTA更能有效防止DNA 損傷。可見，核酸內(nèi)切酶抑制劑的效果因物種而異，需根據(jù)實(shí)際情況加以選擇。

海藻糖是凍干保存精子研究中應(yīng)用最廣的一類非還原性雙糖，其突出優(yōu)點(diǎn)是具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和穩(wěn)定性，能夠在極端環(huán)境下保持穩(wěn)定并保護(hù)精子細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)。Oldenhof 等[32]對(duì)馬凍干保存精子研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖在凍干保存過(guò)程中會(huì)被吸收，極大地減少精子儲(chǔ)存過(guò)程中的DNA 降解。研究表明，小鼠凍干保存溶液中添加海藻糖可顯著提高ICSI 后2-細(xì)胞胚胎發(fā)育至囊胚的比例[33]。

迷迭香酸是天然抗氧化劑，具有抗增殖、抗自由基和抗氧化作用。在綿羊、豬、狗精子的凍干保存溶液中加入迷迭香酸均可降低精子DNA 的損傷程度，且迷迭香酸處理的凍干保存精子的囊胚發(fā)育率與常規(guī)冷凍保存精子無(wú)顯著差異[29,31,34]。

此外，凍干保存精子保存液的酸堿度對(duì)精子的凍干保存也起關(guān)鍵作用。Kaneko 等[35]報(bào)道微堿性（pH=8.0）溶液有助于保持小鼠精子染色體完整和受精能力。隨后，小鼠[8,35]、牛[18]、豬[36]、兔[15]等不同物種的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)凍干保存精子保存液最適pH 為8.0。

3.2 精液處理方法 用于凍干保存的精液樣品可以是新鮮或冷凍精液，其處理程序通常包括離心、洗滌等，但不同物種間存在一定差異。小鼠、豬、馬、兔、犬等動(dòng)物通常采用新鮮精液進(jìn)行凍干保存處理。其中，小鼠、豬和馬精液采集后通常添加稀釋液，經(jīng)離心去除上清后再加入凍干保存溶液離心，以充分洗滌精子，之后將精子懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，經(jīng)預(yù)冷處理后移入冷凍干燥系統(tǒng)[20-21,32,36-37]。而兔和犬的精液采集后通常直接轉(zhuǎn)入FD 溶液中，孵育10 min 后進(jìn)行冷凍干燥處理[15-16]。牛的冷凍精液質(zhì)量較高且實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，因此對(duì)牛精子的FD 處理既可采用冷凍-解凍精液[17-18]也可利用新鮮精液[26]。

3.3 精子凍干保存壓力和時(shí)間 凍干保存包括冷凍、初次干燥和二次干燥3 個(gè)階段。真空狀態(tài)下更有利于冰的升華，因此凍干保存過(guò)程要在真空中進(jìn)行。真空壓力和干燥時(shí)間的相互作用會(huì)影響精子干燥程度，進(jìn)而對(duì)凍干保存精子產(chǎn)生較大影響[24]。不同物種精子凍干保存過(guò)程所需的壓力和時(shí)間如表2 所示。Kawase 等[10]研究表明，真空壓力對(duì)于小鼠精子的初次干燥至關(guān)重要，當(dāng)真空壓力為0.37 mbar 時(shí)，囊胚發(fā)育率顯著高于0.04 和1.03 mbar。Kwon 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，將豬精子凍干保存處理時(shí)間從4 h 延長(zhǎng)至24 h，會(huì)大大降低凍干保存精子的胚胎發(fā)育能力。

表2 不同物種的精子FD 壓力與時(shí)間一覽表

3.4 凍干保存精子的貯存溫度和時(shí)間 有研究表明，小鼠凍干保存精子分別在4℃和25℃中存儲(chǔ)3 個(gè)月，均不影響其受精后胚胎的發(fā)育能力[7]。同樣，兔FD 精子分別在4℃與25℃中保存8 個(gè)月也不影響其DNA 完整性[28]。但Kwon 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，豬凍干保存精子儲(chǔ)存于25℃中與儲(chǔ)存在4℃相比，ICSI 后胚胎發(fā)育率顯著降低，且無(wú)法發(fā)育至囊胚。同樣，儲(chǔ)存在4℃的狗凍干保存精子DNA 損傷率也顯著低于22℃[31]。可見，低溫更有利于凍干保存精子貯存，且4℃保存更經(jīng)濟(jì)，更有利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸，是保存凍干保存精子的理想溫度。

4 存在的問(wèn)題與研究方向

迄今為止，除嚙齒類動(dòng)物外，利用凍干保存精子尚未達(dá)到令人滿意的效果。諸多因素影響了凍干保存精子在家畜中的應(yīng)用，尤其是冷凍過(guò)程因冰晶形成、滲透脫水和機(jī)械力的作用，可能導(dǎo)致精子發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)變化。在今后研究中，可針對(duì)不同物種的特性，深入研究如何改善緩沖液組成以制備理想的凍干保存精子保存液。此外，應(yīng)對(duì)凍干保存過(guò)程中的壓力、溫度和時(shí)間的改進(jìn)，將有助于凍干保存精子的長(zhǎng)期保存。另外，進(jìn)一步改善ICSI 技術(shù)，提高注入凍干保存精子后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，最大限度地減少技術(shù)本身對(duì)卵母細(xì)胞的損傷，提高其后續(xù)的激活能力，也有利于凍干保存精子的應(yīng)用。