氧化應激對蛋雞產蛋后期繁殖性能的影響研究進展

李先強，吳 艷，王家鄉，程詩彬，皮勁松，張 昊，沈濤濤，黃竹林，王孝忠

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所，動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434103；3.武漢民族科技飼料有限公司，湖北武漢 430223；4.湖北省宜昌市動物疫病預防控制中心，湖北宜昌 443005）

在蛋雞養殖過程中，產蛋期分為初產期、高峰期、產蛋后期3 個時期，當產蛋率降至高峰期的80% 時便進入產蛋后期（約400 日齡）[1]，進入產蛋后期蛋雞的生產性能下降、蛋品質變差[2]。卵巢在衰老過程中表現為卵泡耗竭和卵母細胞質量下降[3]，進而導致卵巢功能持續下降，家禽繁殖力也不斷下降。在所有導致卵巢衰老的因素中，由于過度排卵產生的活性氧（ROS）積累引起的氧化應激是最主要的因素之一，氧化應激可引起線粒體損壞、顆粒細胞凋亡、卵泡衰竭、繁殖性能下降，從而導致產蛋量降低?？寡趸烙到y對氧化應激產生調節作用，該系統本身也受氧化應激的影響，如氧化應激對卵母細胞抗氧化能力的調節，故解析產蛋后期氧化應激產生的原因與途徑，探明氧化應激與抗氧化能力之間的相互作用，是研究產蛋后期產蛋性能下降的一個重要切入點。本文綜述了產蛋后期蛋雞氧化應激產生的機理及氧化應激對蛋雞繁殖性能的影響機制，為蛋雞衰老過程中抵抗氧化應激，緩解蛋雞卵巢衰退，延長蛋雞使用年限，提高蛋雞產蛋量及養殖經濟價值提供理論依據。

1 蛋雞產蛋后期氧化應激產生的原因及機理

1.1 氧化應激產生的過程 ROS 和活性氮（RNS）包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫（H2O2）、過氧亞硝酸鹽和其他過氧化物、一氧化氮和其他因子。ROS 是通過線粒體內膜在氧化磷酸化和ATP 生成過程中電子泄露形成[4]。氧化應激一般是指內源性或外源性刺激導致機體代謝產生異常而使ROS 和RNS 的量與機體自身的抗氧化防御體系（主要是各種酶類和非酶類的抗氧化劑）之間失衡造成。而氧化平衡是生物體管理生理活動權衡的重要參照點，并通過氧化應激對生殖和衰老的生理活動進行調節[5]。在衰老過程中，由于抗氧化劑水平降低，活性氧生成和清除之間的平衡被打破，從而導致氧化應激[6]。

1.2 蛋雞卵巢衰老與氧化應激 卵巢作為雌性動物生殖系統中最重要的生殖器官，其衰老現象比任何器官出現的時間都要早[7]，其衰老的標志是卵泡耗竭和卵母細胞質量下降[3]，而在蛋雞養殖中，卵巢也更易出現衰老跡象，這種卵巢過早衰老的現象可能并不是由于正常衰老所引起。與家養禽類相比，野生鳥類一般性成熟較晚，產蛋數量極少，卵巢機能的衰退速度緩慢[8]，故高產蛋雞卵巢機能的快速衰退可能與大量排卵有關[9]。有研究認為，年齡相關的功能紊亂是由于生理上的積累對生物分子造成不可修復的損傷，這是正常新陳代謝不可避免的副作用，同時強調防御修復能力的重要性[10]。Tarin等[11]首次提出卵巢老化是由于卵母細胞和顆粒細胞對抗ROS的能力降低，而ROS 積聚是與衰老相關的細胞損傷最重要的生理誘因之一，卵巢長期處于氧化應激的微環境是導致卵巢衰退的主要原因[12]。因過度排卵導致產蛋后期ROS 不斷聚集，生理性ROS 水平被認為在卵泡發生、卵母細胞成熟和排卵過程中起到維持正常信號轉導途徑的作用[13]，但高ROS 水平會導致氧化損傷[14]。有研究表明，氧化應激與顆粒細胞功能障礙和凋亡有關[15-16]；在大鼠體內，氧化應激可誘導顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖[17-18]。與哺乳動物類似，母雞在衰老過程中由于卵巢氧化應激增加，繁殖力也會嚴重下降[19]。大量研究結果表明，老齡雞卵巢組織中ROS 水平過高導致竇狀卵泡閉鎖、顆粒細胞凋亡和繁殖能力降低[15,20-21]。故產蛋后期生產性能和蛋品質下降的主要原因是長期產蛋積累的氧化應激[22]。

1.3 蛋雞產蛋后期抗氧化機理 抗氧化劑和氧化劑之間的平衡被認為是反映組織或器官抗氧化能力的一個重要參數，細胞內ROS 水平與內源性抗氧化劑之間的關系對這一指標有重要影響。隨著年齡增長，機體酶抗氧化防御能力降低從而導致ROS 產生增加，而非酶活性物質（抗壞血酸、硫醇和生育酚）似乎不會隨著年齡增長而減少[23]。參與體內氧化還原穩態的各種酶系統將ROS 維持在較低水平，保護組織免受氧化、亞硝基損傷[24]，在維持內部環境中起到重要作用[25]。

細胞中存在復雜的清除ROS 的抗氧化系統，參與活性氧解毒過程的常見酶有超氧化物歧化酶（SOD）催化從O2-到O2或H2O2的轉化；CAT 催 化H2O2分解為H2O 和O2；和過氧化物酶家族成員有助于減少H2O2和脂質過氧化物[5]。另一方面，一氧化氮（NO）被過氧化還原酶（PRDX）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）等酶分解。對于非酶還原能力，谷胱甘肽（GSH）和NAD（P）H 是電子供體，谷胱甘肽可以被氧化形成谷胱甘肽二硫化物（GSSG），GSSG 可以通過谷胱甘肽還原酶利用NAD（P）H 還原回到谷胱甘肽。同時也存在一些其他活性氧傳感器，如轉錄因子核因子Erythroid 2 相關因子2（Nrf2），也是調節細胞氧化還原狀態的關鍵。Nrf2 由阻遏物Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Keap1）組成型表達，但保持低水平。Keap1 通過泛素-蛋白酶體途徑結合并促進Nrf2 降解。在氧化應激下，Keap1 上的半胱氨酸殘基被修飾，由此產生的構象變化導致Nrf2 釋放。釋放的Nrf2 隨后被穩定并反式定位到細胞核中，激活抗氧化反應元件（ARE）和許多編碼抗氧化蛋白的下游基因，包括硫氧還蛋白（TXN）和谷胱甘肽-二硫還原酶（GSR），其作用是降低細胞ROS水平[26-27]。

在哺乳動物中，衰老導致內源性ROS 水平升高和抗氧化防御能力下降，導致細胞結構中廣泛的氧化損傷，包括膜的脂質過氧化、酶失活、蛋白質氧化和DNA 損傷[28]，其中抗氧化酶的下調，特別是線粒體抗氧化酶，會導致ROS 水平升高，導致卵巢氧化損傷[18]。在雞卵巢老化過程中，細胞內巰基氧化還原穩態和細胞抗氧化防御能力降低，導致卵巢氧化損傷增加，且與年齡相關的氧化損傷可能隨著年齡增長而使卵巢功能不斷下降[18]。Bodey 等[25]對野生遷徙鳥類氧化狀態及其變異后果進行縱向研究，發現鳥類平衡其用于對抗氧化應激的資源，這種個體分配權衡集中于減少ROS 產生的程度，而不是消除或修復所造成的損害。這也解釋了因過度排卵導致的氧化失衡所致使的卵泡衰竭，從而使老齡雞繁殖功能下降。

2 氧化應激對蛋雞繁殖性能調控機制研究

禽類的氧化應激始于原子水平，化學反應發生于線粒體，線粒體裂解使卵巢顆粒細胞凋亡、抗氧化能力減弱，最終導致卵泡衰竭閉鎖，氧化應激通過這一過程實現對老齡雞繁殖性能的影響（圖1）。

圖1 氧化應激影響微觀至宏觀過程[29]

2.1 氧化應激對顆粒細胞及其線粒體的影響 作為卵泡內數量、比重、功能最多的細胞，顆粒細胞在卵泡成長發育過程中發揮重要作用[30]，其中最重要的便是決定卵泡閉鎖。而閉鎖卵泡數量直接決定蛋雞產蛋率。卵泡閉鎖分為竇閉鎖、基底閉鎖、終末分化凋亡3 種表型，每種都有不同的啟動和調節機制，但都涉及顆粒細胞凋亡[31]。凋亡誘導主要有生存因子、死亡受體和細胞損傷3 個方面。生存因子和促凋亡因子之間的微妙平衡保證卵泡發育和卵巢功能的正常，也影響生殖衰老的程度[3]。而因氧化應激而裂解的線粒體正是打破這種平衡的關鍵性因素。

線粒體是細胞呼吸的場所，是大多數細胞內源性活性氧產生的主要場所[32]，同時也被認為是組織老化的起搏器，在老齡動物中持續產生氧和氮的自由基，衰老相關的細胞呼吸鏈電子傳遞能力降低，電子不斷泄露產生過量ROS，造成與線粒體功能相關的氧化損傷[33]，導致卵巢顆粒細胞凋亡、卵母細胞退化，進而引起廣泛性的氧化應激，加劇線粒體功能失常[34]、線粒體DNA氧化損傷[35]等現象，最終導致卵子質量下降[36]，影響雞產蛋后期的繁殖性能，故線粒體功能的維持被認為是延長繁殖壽命的重要因素。其中線粒體動力學蛋白的改變是導致凋亡的重要原因[37]，氧化應激導致線粒體膜裂變，產生大量裂解的線粒體，釋放Cyt-C 和其他凋亡因子[38-39]，激活p53 特異性信號通路，觸發凋亡機制[40]，激活半胱天冬酶級聯蛋白，形成Cyt-C/Apaf1/caspase-9凋亡小體導致Caspase-3 裂解，最終使細胞凋亡[41]。除衰老因素外，有研究表明，其他因素引起的氧化應激也能促使線粒體裂解，熱暴露誘導的氧化應激與雞線粒體復合體的活性被抑制與有關[42]，NH3的吸入也會導致肉仔雞線粒體膜消失，氧化應激增加，并導致線粒體動態蛋白失衡[43]。

在蛋雞衰老的過程中，顆粒細胞的抗氧化能力也會減弱，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、泛醇和細胞色素C（Cyt-C）氧化還原酶、琥珀酸脫氫酶（SDH）水平下降導致清除自由基的能力降低，導致線粒體中ROS 大量積聚，從而加速顆粒細胞凋亡進程[32,44-45]。生殖衰老與Cu/ZnSOD、MnSOD 和過氧化氫酶（CAT）基因的下調有關，主要涉及線粒體的氧化損傷累積[46]。在顆粒細胞中，抗氧化酶在清除類固醇激素合成過程中產生的超氧陰離子和過氧化氫方面起著至關重要的作用，可能是導致ROS 水平升高的原因。

2.2 氧化應激對卵母細胞抗氧化能力的影響 氧化應激對繁殖性能的影響不僅對卵母細胞有直接作用，隨著機體衰老，卵母細胞抗氧化能力下降，清除ROS 能力減弱，積聚的ROS 將會對抗氧化系統造成進一步破壞，加劇氧化損傷。在人卵巢中，SODs、CAT 和GSSPx 的活性確保了對ROS 的有效清除作用，從而阻止它們迅速擴散到卵母細胞中，SOD 和CAT 活性的年齡依賴性變化導致CAT/SOD 比率降低，GSSPx/SOD 比率略有下降，活性氧清除效率降低[47]。而在老年小鼠的排卵成熟卵母細胞中，GSH 和GST 水平降低，推測可能與SOD活性有關[48]。Lim 等[18]也驗證了小鼠卵巢抗氧化防御能力隨年齡增長而降低，氧化損傷增加的假說。除此以外，有研究發現來自老年小鼠的卵母細胞中，一些抗氧化基因的表達降低，包括Sod1、Glrx1、Gclm、Gsr、GLRX 相關蛋白和Txn1[49-50]。在禽類中，Liu 等[22]研究發現，在蛋雞的自然衰老過程中，Nrf2/HO-1 途徑被下調。番茄紅素通過激活Nrf2/HO-1 途徑來減輕D-Gal誘導的衰老和自然衰老卵巢中的氧化應激。GUO[51]研究表明，日糧中添加丙二醛（MDA）可以提高血清總超氧化歧物酶（T-SOD）活性、肝臟和空腸CAT 活性，提高蛋雞的抗氧化能力，有助于提高蛋雞的生產性能。綜上可知，SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活性是消除活性自由基的保護性反應的重要因素[52]。在產蛋后期雞卵巢中，若其活性降低，過量的自由基會影響功能蛋白、不飽和脂肪酸和核酸，從而對機體功能造成氧化損傷，導致生殖性能下降[22]。

2.3 促性腺激素對氧化應激的影響 卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）的分泌由下丘腦衍生的促性腺激素釋放激素（GnRH）刺激，通過下丘腦-垂體-卵巢軸（HPG 軸）的反饋回路提供控制卵泡選擇和優勢的主要機制[40]。促性腺激素在促進卵泡發育、閉鎖、排除的過程中起到重要作用，在哺乳動物中，雌激素（E2）和FSH 可作用于下丘腦和垂體，并調節卵巢卵泡和卵子的生成[53-54]，卵巢老化的過程伴隨著雌激素的顯著減少。研究表明在小鼠體內E2能激活抗氧化酶SOD、CAT 和GPx 的表達[55]。E2在SOD、CAT、GPx 等 抗氧化劑mRNA 表達中起著積極的作用。雌激素缺乏會降低SOD，增加超氧陰離子自由基，并導致抗氧化酶調節活性氧的生成[56]。有研究發現，促性腺激素可能不是產蛋后期家禽卵巢機能衰退的主要因素[57]。產蛋量的正常下降與母雞黃體生成素高峰之間的間隔變化無關[58]。然而Niranjan 等[59]研究認為E2在氧化應激過程中起重要作用，E2分泌減少，緩解卵巢氧化應激的作用也會降低[60]，而三苯氧胺作為一種抗氧化劑，通過降低雌激素受體α降低氧化應激。綜上所述，在蛋雞衰老過程中，促性腺激素可能在排卵過程中有階段性分泌高峰，但其是否影響卵巢衰退仍需進一步研究。

3 結 語

產蛋后期蛋雞產蛋率下降主要是卵巢衰老造成，而雞卵巢衰老的標志是卵巢卵泡數量減少和卵子質量下降，其主要原因是過度排卵引起產蛋后期細胞內大量ROS 的積聚引起的氧化應激。蛋雞在產蛋后期，卵巢組織中ROS 積聚，卵巢組織抗氧化能力降低、顆粒細胞凋亡、線粒體損傷、氧化應激加劇從而導致產蛋量下降，縮短了種雞的使用年限，影響養殖收益。