骨水泥與骨形態(tài)發(fā)生蛋白對(duì)骨生長的影響

侯青青，楊 越，徐景超

（河南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院1，骨科研究所2，河南 焦作 454000）

骨水泥（bone cement）由白色粉末和無色帶刺激氣味的液體兩部分制劑組成，其最初用于固定股骨假體，現(xiàn)已廣泛用于治療椎體和股骨頸等部位的骨質(zhì)疏松[1,2]，最常用的材料為聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，其可較好地增加椎體強(qiáng)度和緩解疼痛，但存在固化時(shí)發(fā)熱、骨水泥滲漏、體內(nèi)不能生物降解及骨整合等問題[3]。而磷酸鈣骨水泥具有生物相容性、骨傳導(dǎo)性好和在局部能自凝固等特點(diǎn)[4]，但同時(shí)也存在早期力學(xué)性能差、脆性大、降解速度難以控制、不能與新骨生成速度匹配等。有研究表明[5]，羥基磷灰石性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定，具有良好的骨傳導(dǎo)性能和生物活性，是一種理想的骨缺損修復(fù)材料。同時(shí)，納米級(jí)羥基磷灰石更利于與骨組織的整合，骨傳導(dǎo)性能、溶解性能以及力學(xué)性能更強(qiáng)，且植入動(dòng)物體內(nèi)沒有物理損害。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一組具有類似結(jié)構(gòu)的高度保守的功能蛋白，它可以刺激DNA 的合成和細(xì)胞的復(fù)制，促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞，產(chǎn)生新生骨，具有誘導(dǎo)成骨作用[6，7]。本研究以納米羥基磷灰石作為主要材料制作骨水泥，觀察骨水泥對(duì)骨骼生長的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 骨水泥材料 納米羥基磷灰石2 g、BMP 60 mg、聚酰胺1 g、氫氧化鎂5 g、殼聚糖1 g、六水合氯化鎂5 g、羥丙甲基纖維素1 g、納米二氧化硅1 g、無水乙醇5 g、丙酮2 g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 健康白色成年新西蘭家兔20 只，雌雄不拘，體質(zhì)量為4.1～4.8 kg，體溫38.5 ℃～39.5 ℃，由河南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供提供。飼育室室溫（20±3）℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜光照節(jié)律12 h∶12 h，兔糧每日食用量為400～500 g，自由飲食水。兔臺(tái)、滅菌鍋、刮胡刀、布巾鉗、鑷子、刀片、刀柄、直剪、彎剪、止血鉗、彎止血鉗、紗布、電鉆、Alice、針、線、水合氯醛、生理鹽水、酒精、碘伏、青霉素。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理與實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆先祟惖牡赖聜惱順?biāo)準(zhǔn)和國際慣例，符合3R 規(guī)則。

1.1.3 骨組織切片的儀器及試劑 切片機(jī)（湖北伯納醫(yī)療科技有限公司）、HS-1145 病理組織漂烘儀（金華市華速科技有限公司）、恒溫干燥箱、通風(fēng)櫥、奧林巴斯熒光顯微鏡（奧林巴斯<深圳>工業(yè)有限公司）、HE 染色試劑、10%中性甲醛固定液、水楊酸脫鈣液、改良Jenkins 脫鈣液、1 mol/L 氫氧化鈉溶液、鹽酸乙醇分化液、剃度乙醇溶液、二甲苯、石蠟、蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 骨水泥制作分別稱取羥基磷灰石2 g、聚酰胺1 g、氫氧化鎂5 g、殼聚糖1 g、六水合氯化鎂5 g、羥丙甲基千維素1 g、納米二氧化硅1 g、無水乙醇5 g、丙酮2 g，放入研缽充分研磨，研磨充分之后取出放入烤箱60 ℃下烘干，再在空氣中進(jìn)行晾曬，第2 天基本上凝固成型，即可進(jìn)行骨水泥填充。

1.2.2 兔子實(shí)驗(yàn)過程 選取家兔20 只，每5 只為1組，共分為4 組。兔子左側(cè)植入骨水泥復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白材料設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，另一側(cè)植入單純羥基磷灰石骨水泥材料設(shè)為空白組。每只兔子過程相同，首先于術(shù)前禁食3 d。配置麻醉藥物，取水合氯醛1 g，生理鹽水10 ml 混合均勻。將實(shí)驗(yàn)兔子放置在手術(shù)臺(tái)，用刮胡刀剃毛，并用剃毛膏去除多余雜毛。在耳緣靜脈注射4 ml 麻醉藥物，觀察兔子反應(yīng)，10 min 后，如家兔瞳孔仍有反射，補(bǔ)加麻藥4 ml，觀察家兔瞳孔無反應(yīng)后即麻醉完全。開始手術(shù)，在兔子左股骨手術(shù)部位用碘伏消毒，見圖1，再用手術(shù)刀和鑷子接連劃開皮膚、布膜、肌肉和骨膜，暴露出骨頭，找到股骨，在股骨處鉆孔，鉆出半徑約2 mm 的孔，放入術(shù)前制作好的骨水泥，見圖2，然后用生理鹽水沖洗傷口，并將生理鹽水和青霉素混合注射進(jìn)傷口周圍的肌肉，注射3～4 針。隨后縫合，用小針縫合肌肉，用大針縫合皮膚，最后用碘伏消毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)兔子日常生活進(jìn)行觀察記錄，6 周后進(jìn)行X光片檢查。

圖1 股骨處碘伏消毒

圖2 復(fù)合骨水泥填充

1.2.3 骨切片實(shí)驗(yàn)步驟 選取骨水泥手術(shù)的家兔，將家兔通過耳緣靜脈推注空氣致死，取出雙側(cè)股骨，剔除多余肌肉組織，放在10%中性甲醛溶液中固定。選擇水楊酸脫鈣液、改良Jenkins 脫鈣液進(jìn)行脫鈣，接著在10%中性甲醛中固定24 h。固定之后選擇Jenkins 脫鈣液（鹽酸4 ml、醋酸3 ml、氯仿10 ml依次加入10 ml 蒸餾水，再加進(jìn)73 ml 無水乙醇）進(jìn)行脫鈣，脫鈣4 d 之后用1 mol/L 氫氧化鈉溶液除酸。再用流水沖洗10 min，之后再依次用50%酒精脫水1 h、75%酒精脫水1 h、85%酒精脫水1 h、95%酒精脫水1 h、無水乙醇脫水30 min 2 次。接著進(jìn)行透明、浸蠟、包埋、切片、展片、撈片、烤片，即用刀片將包有組織的蠟塊進(jìn)行修剪，調(diào)試好切片機(jī)，裝上蠟塊，用切片機(jī)切成薄片，取較為完整的組織薄片，用鑷子輕輕鑷起平鋪在40 ℃～45 ℃的水面。待蠟片平展后將其撈至載玻片中段，傾掉多余的水，置于60 ℃～65 ℃恒溫箱內(nèi)或漂烘儀烤箱處烤片15～30 min。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開始脫蠟，染色，最后脫水，封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以（n）進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 骨水泥填充結(jié)果 兔子傷口愈合情況良好，體重較穩(wěn)定，無異物無免疫排斥反應(yīng)及其他感染現(xiàn)象發(fā)生。術(shù)后6 周拍片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組骨缺損間隙模糊，材料體積變小，新骨形成多，并且骨連接緊密；空白組部位有空隙存在，材料變化不明顯，見圖3。此外，實(shí)驗(yàn)組新骨共計(jì)生成10 個(gè)，界限生成7 個(gè)；空白組新骨形成7 個(gè)，界限生成5 個(gè)；從單個(gè)兔子移植骨X 光片結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)組新骨最多生成3 個(gè)，而空白組最多為2 個(gè)，見表1。

表1 兩組術(shù)后6 周移植骨X 光片統(tǒng)計(jì)結(jié)果（個(gè)）

圖3 復(fù)合骨水泥X 光片

2.2 骨切片結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組染色較淺，另外有較多的新骨組織生成，降解明顯；而空白組染色較深，新生骨形成較少，且降解不明顯，見圖4。

圖4 骨切片結(jié)果（HE×400）

3 討論

骨植入材料作為生物材料的重要組成部分，受到臨床廣泛關(guān)注，其中羥基磷灰石因具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性，是一種非常有潛力的骨植入材料。但有研究證明[8]，羥基磷灰石本身不具有促進(jìn)成骨作用，單純的羥基磷灰石很難發(fā)揮作用，做出來的材料很容易散[9]，需要填充其他物質(zhì)相互混合來達(dá)到目的。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）家族中的一員，具有誘導(dǎo)骨形成的作用，與骨骼生物相容性好，親和力高[10]。據(jù)目前研究發(fā)現(xiàn)[11,12]，BMP-2、3、4、14 等可用于骨修復(fù)，另外通過不同的填充材料，對(duì)骨修復(fù)的能力也會(huì)有不同的影響。BMPs 不單單能單獨(dú)介導(dǎo)促成骨生長，并且還能與其他骨生長因子混合，以此來增強(qiáng)骨生長的效果。骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合骨水泥與人體骨的構(gòu)成較為相似，其組成的實(shí)驗(yàn)組材料可通過生物活性更好地形成新骨。骨形態(tài)發(fā)生蛋白骨水泥除了促進(jìn)生物體的骨組織生長外，對(duì)生物體本身也不會(huì)造成危害，還具有較好的生物相容性、生物降解以及傳導(dǎo)成骨活性，可迅速凝固，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生刺激，也不會(huì)影響其他材料的生物活性[13]。研究表明[14,15]，骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有傳導(dǎo)成骨的作用，而羥基磷灰石有誘導(dǎo)成骨作用，二者結(jié)合，相互彌補(bǔ)不足，又同時(shí)發(fā)揮著自身作用，使實(shí)驗(yàn)材料發(fā)揮最大的功效。同時(shí)，因骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有降解性，最后會(huì)隨著新骨的形成而被降解。本研究在兔子左右股骨處分別植入骨水泥復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白材料和單純羥基磷灰石骨水泥材料，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組骨缺損間隙模糊，材料體積變小，降解明顯，且新骨形成多，骨連接緊密；此外，實(shí)驗(yàn)組在新骨和界限生成數(shù)量上大于空白組；骨組織切片結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組染色較淺，另外有較多的新骨組織生成，降解明顯；而空白組染色較深，新生骨形成較少，且降解不明顯，這可能與新骨形成速度與單純材料降解速度不一致導(dǎo)致的，提示實(shí)驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)材料具有較高的誘導(dǎo)成骨的活性，使新骨形成的速度大于空白材料降解的速度，因此未有空隙產(chǎn)生。

綜上所述，復(fù)合材料骨水泥對(duì)周圍骨組織有促進(jìn)生長的作用，且對(duì)周圍骨組織無不良影響，無排斥反應(yīng)。