血清學(xué)方法結(jié)合基因分型技術(shù)鑒定獻血者ABO 疑難血型

汪全民，萬 琳

（上饒市中心血站輸血研究室，江西 上饒 334000）

獻血者血型的正確定型是保證臨床輸血安全的首要條件，ABO 血型系統(tǒng)免疫原性強，輸入非相容的血液制品會導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)，甚至?xí)＜笆苎叩纳黐1]。因此，采供血機構(gòu)對獻血者血型的正確定型至關(guān)重要，而在實際工作中往往因為不規(guī)則抗體、ABO 亞型、年齡、疾病等因素干擾，造成血型定型困難，血清學(xué)方法有時難以區(qū)別真正的原因，需要采取更加準確的方法進行鑒定。為此，本研究收集了本血站近兩年ABO 血型正反定型不符的獻血者標(biāo)本26例，通過血型血清學(xué)方法和基因分型技術(shù)對其進行血型鑒定分析，旨在為正確定型獻血者ABO 血型及安全有效輸血提供保障，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019 年8 月-2021 年7 月由上饒市中心血站檢驗科送檢的ABO 正反定型不符標(biāo)本26例，剔除重復(fù)獻血者，排除初篩血型錯誤，通過血型血清學(xué)方法鑒定不規(guī)則抗體干擾19例，疑似ABO亞型7例；年齡19～44歲；其中女性5例，男性2例；初次獻血者6例，獻血3 次1例。

1.2 試劑與儀器 ABO 血型正定型試劑、抗-H、Rh分型試劑、MN 血型試劑、反定型紅細胞、抗球蛋白試劑、抗體篩選紅細胞、譜細胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供）；抗-A，B（法國DIAGAST 公司提供）；檢測儀器為KA-2200型離心機（日本Kubota 公司）；DHW-600型電熱恒溫水箱（北京國華醫(yī)療器械廠）。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清學(xué)方法 ①ABO 血型鑒定采用鹽水試管法，檢出較弱的抗原或抗體時加做抗-H 和抗-A，B，根據(jù)血清結(jié)果加做吸收放散試驗；②標(biāo)本為不規(guī)則抗體陽性的，進行抗體特異性鑒定，檢出抗-M、抗-E抗體的標(biāo)本，使用M 和E 陰性A、B、O 紅細胞進一步驗證反定型結(jié)果（M 和E 陰性紅細胞使用相應(yīng)抗血清篩查獻血者標(biāo)本得到），同時確定是否存在ABO血型抗體減弱（凝集強度＜2+）。實驗操作按照參考文獻[2]標(biāo)準進行，ABO 血型結(jié)果判讀按照參考文獻[3]；③Rh 表型和MN 血型檢測方法，試管中加1 滴抗血清，每管中加1 滴2%～5%待檢紅細胞室溫反應(yīng)10 min，1000 g 離心15 s 后看結(jié)果；④自身冷凝集素用自身紅細胞吸收血漿中的冷抗體（4 ℃吸收2 h）后做反定型，紅細胞使用37 ℃鹽水洗滌3 次后做正定型。

1.3.2 基因分型檢測方法 7例疑似ABO 亞型標(biāo)本送檢至天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司行基因檢測，PCR-SSP 特異性引物和內(nèi)參引物設(shè)計依據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫公開的基因序列信息，針對其基因突變或缺失、插入等信息設(shè)計特異引物；ABO 基因測序根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database 綜合結(jié)果判定（以A101 為參考序列）。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)結(jié)果 26例疑難標(biāo)本中19例存在不規(guī)則抗體，其中15例抗-M 抗體（78.95%），1例抗-E 抗體，1例抗-P1 抗體，1例自身冷凝集素，非特異性抗體1例；在19例標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)血型抗體減弱，見表1。

表1 19例獻血者ABO 正反定型不符血型血清學(xué)結(jié)果

2.2 PCR-SSP 檢測情況 7例標(biāo)本檢測結(jié)果：4例B/O，1例A/O02，1例B/O01，1例A307/O02 為A3 亞型，見圖1。

圖1 6號標(biāo)本PCR-SSP 基因分型結(jié)果

2.3 PCR-SBT 基因測序 6例標(biāo)本進行了PCR-SBT基因測序，發(fā)現(xiàn)其中2例樣本（表2 中1號、3號）存在O01O02B（由于只檢測了B 基因的第7 外顯子，無法確定B 基因的具體基因型）3 種等位基因，屬血型嵌合體；4例標(biāo)本（表2 中2號、4號、5號、7號）血清學(xué)結(jié)果初步判定為亞型，采用PCR-SBT基因測序排除亞型，基因型分別是1例A102/O02，2例B101/O01，1例B101/O02，見表2、圖2～圖4。

圖2 1號、3號標(biāo)本ABO 血型第6 外顯子測序圖

圖3 1號、3號標(biāo)本ABO 血型第7 外顯子測序圖

圖4 1號、3號標(biāo)本ABO 血型第7 外顯子B 基因單鏈測序圖

表2 7例疑似ABO 亞型血清學(xué)及基因分型結(jié)果

3 討論

血型鑒定是指采用特異性抗體與相應(yīng)抗原的免疫反應(yīng)，根據(jù)紅細胞凝集情況確定血型的技術(shù)[4]；血型鑒定的影響因素較多，不規(guī)則抗體是其中之一。本次研究的26例標(biāo)本中有19例存在不規(guī)則抗體，15例存在抗-M，與譚慶芬[5]的報道基本一致。血站檢驗科一般采用自動化設(shè)備進行血型檢測，常因獻血者血漿含有不規(guī)則抗體，在應(yīng)用了含有相應(yīng)抗原的反定細胞檢測時，A 細胞、B 細胞和O 細胞受到干擾造成正反定型不符。不規(guī)則抗體引起血型鑒定困難主要發(fā)生在IgM 類抗體，偶爾也有IgG 類。MN 血型系統(tǒng)中的IgM 抗-M 屬于冷反應(yīng)抗體，多為天然產(chǎn)生（IgM），37 ℃無反應(yīng)，而因妊娠與輸血等產(chǎn)生免疫性抗-M 抗體（IgG 類），再次接觸足夠多的M 抗原時，IgG 的抗-M 亦能造成凝集反應(yīng)[6]，均會干擾反定型的鑒定，此次未對不規(guī)則抗體的類型進行鑒定，為確保ABO 血型準確定型，應(yīng)用M 陰性A，B，O 紅細胞鑒定反定型，驗證正反定型結(jié)果，防止因不規(guī)則抗體掩蓋漏檢亞型和抗體減弱的標(biāo)本。

冷凝集素是一種大分子抗體，其結(jié)合紅細胞具有可逆性，對溫度較敏感，4 ℃反應(yīng)最強，可與自身紅細胞和他人紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)，當(dāng)溫度升高時活性減弱，凝集消失[7]。本次研究的19例存在不規(guī)則抗體的標(biāo)本中，1例存在室溫下反定型細胞和自身細胞均出現(xiàn)1+的凝集，使用篩選紅細胞鹽水反應(yīng)與反定型凝集強度一致，血漿經(jīng)4 ℃自身紅細胞吸收后再做ABO 反定型為AB型，紅細胞經(jīng)過37 ℃洗滌后做正定型，凝集強度均為4+，符合冷凝集素的特征。1例抗-P1 抗體僅僅出現(xiàn)O 細胞呈現(xiàn)弱凝集，在使用另一廠家的反定型紅細胞復(fù)查血型時，結(jié)果為正常的B型，提示廠家不同的反定型紅細胞其抗原譜有差別。對另1例抗體無特異性的標(biāo)本，經(jīng)查詢該獻血者在之前已獻血2 次，根據(jù)以往檢測結(jié)果與本次反定型凝集強度可以判定為正常的O型。本次研究發(fā)現(xiàn)1例抗-E 抗體在鹽水反定型中出現(xiàn)1+凝集，在抗體鑒定時與普細胞出現(xiàn)1+～2+的凝集強度，在應(yīng)用E 陰性紅細胞做反定型時為正常的B型，在Rh 血型系統(tǒng)中，因RhE 抗原陰性和陽性在人群分布中很接近，故爾容易產(chǎn)生不規(guī)則抗體，而E抗體一般為免疫刺激產(chǎn)生的IgG型，偶爾也有IgM型抗體。

ABO 亞型主要由于紅細胞糖基轉(zhuǎn)移酶基因第6和7 外顯子的點突變或單堿基缺失等原因，降低或改變了酶的活性，導(dǎo)致A 或B 抗原的弱表達[8]。1936年，F(xiàn)riedenreich 發(fā)現(xiàn)了A3 亞型，A3 亞型與抗-A 反應(yīng)較弱，是最罕見的弱A 表現(xiàn)型，我國人群的A3 頻率還未見報道[9]。本次應(yīng)用PCR-SSP 共檢測7例標(biāo)本，其中檢出1例A307/O02 A3 亞型，A3 亞型是最稀少的弱A 表現(xiàn)型，我國首次報道A307 等位基因是2007 年臺灣地區(qū)[10]，之后在上海、福州等地區(qū)也有其報道[11，12]，其血清學(xué)特點是當(dāng)紅細胞與抗-A 和抗-AB 反應(yīng)時表現(xiàn)為“混合視野外觀”，A3 血清中偶然存在抗-A1，在分泌型個體的唾液中可以檢測到A物質(zhì)。而該標(biāo)本血清學(xué)結(jié)果與抗-A、抗-A，B 呈現(xiàn)弱凝集，未出現(xiàn)典型的混合視野，抗-H 的凝集強度與O 細胞一致，反定型A1 細胞出現(xiàn)弱凝集，根據(jù)A3亞型血清學(xué)特點，存在抗-A1 抗體。該血樣未進行基因測序，其基因突變點不明確，但據(jù)文獻報道[13，14]，第7 外顯子第467 位和745 位均發(fā)生C＞T 的堿基突變?yōu)锳307 等位基因，該突變點可導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶的活性改變，引起A 抗原的弱表達。

本次研究的另外6例標(biāo)本經(jīng)PCR-SSP 未明確血型，采用基因測序（PCR-SBT）檢出2例標(biāo)本存在（O01/O02/B）3 種等位基因，屬血型嵌合體，在第6外顯子檢測到261delG 缺失的純合突變，說明2 條染色體均存在O 等位基因，在第1 次測序過程中未發(fā)現(xiàn)B 等位基因，可能被O 等位基因所掩蓋，因此樣本繼續(xù)進行了B 基因的單鏈測序，測序結(jié)果顯示，該樣本存在B 等位基因在第7 外顯子上的特征性突變點，根據(jù)第3～7 外顯子測序結(jié)果表明存在O01/O02/B 三種等位基因，該2例標(biāo)本血清學(xué)結(jié)果抗-B、抗A，B 均出現(xiàn)1+mf 的混合凝集，根據(jù)孔存權(quán)等[15]的報道，嵌合體的等位基因是造成抗原弱表達的原因之一。另外4例標(biāo)本采用PCR-SBT 基因測序排除亞型。2號標(biāo)本經(jīng)吸收放散檢出A 抗原，呈現(xiàn)Ael 亞型格局，存在正常的A 基因但未發(fā)現(xiàn)基因突變點。4號標(biāo)本吸收放散未檢出A 抗原，正定型與基因檢測結(jié)果一致，反定型抗體減弱。另外2例標(biāo)本正定型均出現(xiàn)混合視野，反定型結(jié)果正常，測序結(jié)果證明存在B 基因。上述4例標(biāo)本血清學(xué)結(jié)果異常，DNA基因測序未發(fā)現(xiàn)基因突變，可能是基因調(diào)控區(qū)域表達問題或者是疾病等原因造成抗原抗體減弱[16]，此外，ABO 基因啟動子突變也可以導(dǎo)致ABO 血型抗原表達的減弱[17-19]。

綜上所述，引起ABO 疑難血型鑒定的因素較多，對于供血者ABO 血型的準確鑒定關(guān)乎臨床安全輸血，錯誤的血型定型將導(dǎo)致輸血無效甚至危及患者生命安全，血清學(xué)方法鑒定血型因生理性、病理性因素干擾，難以對疑似ABO 亞型標(biāo)本準確定型，分子生物學(xué)基因分型技術(shù)從基因的角度對血型鑒定，克服了血清學(xué)方法的上述局限，使ABO分型結(jié)果更加準確可靠，個體識別能力進一步提高。