龍膽苦苷對H22 肝癌小鼠腫瘤生長抑制及抗血管生成的分析

張志恒,賈海燕,崔朝初,張瑩雪

(1.聊城市中醫醫院腫瘤科,山東聊城 252000;2.河南科技大學醫學院,河南洛陽 471000;3.山東中醫藥大學藥學院, 濟南 250355)

肝癌在我國高發,具有預后差、易轉移復發、生存時間較短及惡性程度高等特點,在腫瘤引起的相關死亡中高居第2 位[1]。 化學治療是治療肝癌的常用手段,但常導致消化道及肝、腎損傷、骨髓抑制,并出現白細胞減少、便秘、腹痛腹瀉、食欲不振、惡心嘔吐等不良反應[2]。 龍膽苦苷是我國傳統中藥龍膽草及秦艽中的主要活性物質,屬于環烯醚萜苷類化合物,具有健胃利膽、抗病原微生物、抗炎及保肝等多種藥理作用[3]。 體外實驗發現[4-7],龍膽苦苷對人卵巢癌及肝癌細胞等的增殖有抑制作用,但關于龍膽苦苷的體內抗腫瘤作用研究未見報道。因此,本研究以H22肝癌小鼠為研究對象,主要探討龍膽苦苷對H22肝癌小鼠腫瘤生長抑制及抗血管生成分析,以期為進一步的臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級 KM 雄性小鼠 60 只,體重 20~22 g,來源于北京維通利華公司[SCXK(京) 2017-0033]。 無菌手術在山東大學實驗動物中心進行[SYXK(魯)2019-0005]。 本實驗獲我院倫理委員會審批通過(LCZYYY2020012707),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞

肝癌H22細胞,購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

龍膽苦苷為南京道斯夫公司產品,批號181116A,純度>95%;干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒,購于深圳達科為生物公司,批號分別為20180516、20180427;兔抗鼠堿性成纖維生長因子(bFGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)抗體均購于美國 Abcam 公司, 批號分別為ab246354、ab229856、ab69479、ab154598、ab182651、ab8805、ab38449。 Epoch 型酶標儀,美國 Bio-tek 公司;蛋白電泳及轉膜儀,美國Bio-Rad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 H22肝癌小鼠模型的建立

將培養至對數生長期的H22細胞接種于KM 小鼠,7 d 后抽取腹水,經D-Hanks 液洗滌后離心,并調整細胞懸液密度為每毫升5.0×106個。 在小鼠右腋皮下注射上述細胞懸液0.2 mL,建立H22肝癌小鼠模型。

1.3.2 分組及給藥

造模后將小鼠按體重隨機分為4 組,分別為模型組、龍膽苦苷低、高劑量組(50 mg/kg、100 mg/kg)及陽性藥物環磷酰胺組(20 mg/kg),每組10 只;另選取10 只健康小鼠,作為正常組。 分組后第2 天開始給藥,龍膽苦苷低、高劑量組灌胃給藥,每天一次;環磷酰胺組腹腔注射給藥,隔天一次;正常組及模型組灌胃等體積的生理鹽水。 給藥周期為14 d,記錄造模前及治療14 d 后的各組小鼠體重。

1.3.3 瘤重、抑瘤率、胸腺指數和脾指數測定

在末次給藥后24 h,各組小鼠采用頸椎脫臼法處死。 剝離腫瘤組織及胸腺、脾,濾紙拭去表面殘余血液后,電子天平精密稱重。 按下式分別計算抑瘤率、胸腺指數和脾指數。

1.3.4 ELISA 法測定各組小鼠血清 IFN-γ 及 IL-2含量

各組小鼠在處死前,取血,分離血清。 按照ELISA 檢測試劑盒說明書中的操作步驟,分別檢測各組小鼠血清IFN-γ 及IL-2 含量。

1.3.5 蛋白免疫印跡法測定各組小鼠瘤組織相關蛋白表達

采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行目的蛋白的分離。 電泳完成后,常規操作轉膜,其中兔抗鼠 bFGF、TGF-β、VEGF、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 及 β-actin 抗體,均為 1 ∶1000 倍稀釋,二抗為1 ∶2000 倍稀釋。 采用電化學發光法顯色并拍照,蛋白條帶灰度值經Image J 軟件分析后,計算各組目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行分析與統計,所得數據均用“平均數±標準差()”表示,獨立樣本t檢驗用于兩組數據比較,單因素方差分析用于多組數據比較。P<0.05,差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 龍膽苦苷對各組小鼠體重變化的影響

造模前各組小鼠體重無明顯變化(P>0.05);治療14 d 后,與正常組及H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組小鼠體重無明顯變化(P>0.05),而環磷酰胺組小鼠體重明顯降低(P<0.01)。 結果見表1。

表1 龍膽苦苷對各組小鼠體重變化的影響(,n=10)Table 1 Effects of gentiopicroside on body weight of mice in each group

表1 龍膽苦苷對各組小鼠體重變化的影響(,n=10)Table 1 Effects of gentiopicroside on body weight of mice in each group

注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,dP<0.01。Note. Compared with the normal group, bP<0.01. Compared with the model group, dP<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dose體重(g)Body weight造模前Before model establishment治療14 d 后After 14 d treatment正常組Normal group / 20.04±2.42 32.72±3.57模型組Model group / 19.86±2.39 33.53±4.06龍膽苦苷低劑量組Gentiopicroside low does group 50 19.67±1.87 31.61±3.32龍膽苦苷高劑量組Gentiopicroside high does group 100 20.25±2.18 30.87±3.13環磷酰胺組Cyclophosphamide group 20 20.13±1.95 22.41±2.86b,d

2.2 龍膽苦苷對各組小鼠瘤重及抑瘤率的影響

與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠瘤重均明顯降低(P<0.01),龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠的抑瘤率分別為30.43%、42.93%及69.2%。 結果見表2。

表2 龍膽苦苷對各組小鼠瘤重及抑瘤率的影響(,n=10)Table 2 Effects of gentiopicroside on tumor weight and tumor inhibition rate of mice in each group

表2 龍膽苦苷對各組小鼠瘤重及抑瘤率的影響(,n=10)Table 2 Effects of gentiopicroside on tumor weight and tumor inhibition rate of mice in each group

注:與模型組比較,dP<0.01。Note. Compared with the model group, dP<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dose瘤重(g)Tumor weight抑瘤率(%)Tumor inhibition rate正常組Normal group / / /模型組Model group / 1.84±0.23 /龍膽苦苷低劑量組Gentiopicroside low does group 50 1.28±0.15d 30.43龍膽苦苷高劑量組Gentiopicroside high does group 100 1.05±0.12d 42.93環磷酰胺組Cyclophosphamide group 20 0.57±0.06d 69.2

2.3 龍膽苦苷對各組小鼠胸腺指數和脾指數的影響

與正常組比較,H22肝癌模型組小鼠胸腺指數及脾指數無明顯變化(P>0.05),龍膽苦苷低、高劑量組小鼠胸腺指數及脾指數明顯升高(P<0.01),而環磷酰胺組小鼠胸腺指數及脾指數明顯降低(P<0.01);與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組小鼠胸腺指數及脾指數明顯升高(P<0.01),而環磷酰胺組小鼠胸腺指數及脾指數明顯降低(P<0.05或P<0.01)。 結果見表3。

表3 龍膽苦苷對各組小鼠胸腺指數和脾指數的影響(,n=10)Table 3 Effects of gentiopicroside on thymus index and spleen index of mice in each group

表3 龍膽苦苷對各組小鼠胸腺指數和脾指數的影響(,n=10)Table 3 Effects of gentiopicroside on thymus index and spleen index of mice in each group

注:與正常組比較,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。Note. Compared with the normal group, bP<0.01. Compared with the model group, cP<0.05, dP<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dose胸腺指數(mg/10 g)Thymus index脾指數(mg/10 g)Spleen index正常組Normal group / 10.72±1.26 43.53±5.15模型組Model group / 9.26±1.10 41.12±4.64龍膽苦苷低劑量組Gentiopicroside low does group 50 15.48±1.28b,d 51.16±6.24b,d龍膽苦苷高劑量組Gentiopicroside high does group 100 17.55±1.32b,d 62.64±5.96b,d環磷酰胺組Cyclophosphamide group 20 5.31±0.67b,d 36.19±4.03b,c

2.4 龍膽苦苷對各組小鼠血清IFN-γ 及IL-2 含量的影響

與正常組比較,H22肝癌模型組、龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠血清IFN-γ、IL-2 含量均明顯降低(P<0.05 或P<0.01);與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組小鼠血清IFN-γ、IL-2 含量明顯升高(P<0.05 或P<0.01),而環磷酰胺組小鼠血清IFN-γ、IL-2 含量明顯降低(P<0.01)。 結果見表4。

表4 龍膽苦苷對各組小鼠血清IFN-γ 及IL-2 含量的影響(,n=10)Table 4 Effects of gentiopicroside on serum IFN-γ and IL-2 contents of mice in each group

表4 龍膽苦苷對各組小鼠血清IFN-γ 及IL-2 含量的影響(,n=10)Table 4 Effects of gentiopicroside on serum IFN-γ and IL-2 contents of mice in each group

注:與正常組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。Note. Compared with the normal group, aP<0.05,b P<0.01. Compared with the model group, cP<0.05, dP<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dose干擾-γ(mmol/L)IFN-γ白細胞介素-2(mmol/L)IL-2正常組Normal group / 57.94±6.74 110.27±12.24模型組Model group / 40.53±4.06b 48.59±5.17b龍膽苦苷低劑量組Gentiopicroside low does group 50 46.56±5.48b,c 81.10±9.14b,d龍膽苦苷高劑量組Gentiopicroside high does group 100 51.88±5.4a,d 94.31±11.83b,d環磷酰胺組Cyclophosphamide group 20 23.35±2.65b,d 36.08±4.52b,d

2.5 龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織bFGF、TGF-β 及VEGF 表達的影響

與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠瘤組織bFGF、TGF-β 及VEGF 表達均明顯降低(P<0.01)。 結果見圖1 和表5。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織 bFGF、TGF-β 及 VEGF 表達的影響Note. A, Model group. B, Gentiopicroside low does group.C, Gentiopicroside high does group. D, Cyclophosphamide group.Figure 1 Effects of gentiopicroside on the expressions of bFGF,TGF-β and VEGF in tumor tissues of mice in each group by Western blot

表5 龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織bFGF、TGF-β 及VEGF 表達的影響(,n=10)Table 5 Effects of gentiopicroside on the expressions of bFGF,TGF-β and VEGF in tumor tissues of mice in each group

表5 龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織bFGF、TGF-β 及VEGF 表達的影響(,n=10)Table 5 Effects of gentiopicroside on the expressions of bFGF,TGF-β and VEGF in tumor tissues of mice in each group

注:與模型組比較,dP<0.01。Note. Compared with the model group, dP<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dose堿性成纖維生長因子/β-肌動蛋白bFGF/β-actin轉化生長因子-β/β-肌動蛋白TGF-β/β-actin血管內皮生長因子/β-肌動蛋白VEGF/β-actin模型組 Model group / 1.08±0.11 1.12±0.14 0.96±0.09龍膽苦苷低劑量組Gentiopicroside low does group 50 0.46±0.05d 0.81±0.10d 0.73±0.08d龍膽苦苷高劑量組Gentiopicroside high does group 100 0.38±0.04d 0.60±0.07d 0.35±0.04d環磷酰胺組Cyclophosphamide group 20 0.21±0.02d 0.52±0.06d 0.28±0.04d

2.6 龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織p-PI3K 及p-Akt表達的影響

與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠p-PI3K 及p-Akt 表達均明顯降低(P<0.05 或P<0.01)。 結果見圖 2 和表 6。

表6 龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織p-PI3K 及p-Akt 表達的影響(,n=10)Table 6 Effects of gentiopicroside on the expressions of p-PI3K and p-Akt in tumor tissues of mice in each group

表6 龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織p-PI3K 及p-Akt 表達的影響(,n=10)Table 6 Effects of gentiopicroside on the expressions of p-PI3K and p-Akt in tumor tissues of mice in each group

注:與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。Note. Compared with the model group, cP<0.05, dP<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dose磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶/磷脂酰肌醇-3 激酶p-PI3K/PI3K磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B p-Akt/Akt模型組Model group / 0.84±0.09 1.27±0.14龍膽苦苷低劑量組Gentiopicroside low does group 50 0.72±0.08c 0.95±0.11d龍膽苦苷高劑量組Gentiopicroside high does group 100 0.43±0.05d 0.56±0.06d環磷酰胺組Cyclophosphamide group 20 0.31±0.03d 0.35±0.04d

圖2 蛋白免疫印跡法檢測龍膽苦苷對各組小鼠瘤組織p-PI3K 及p-Akt 表達的影響Note. A, Model group. B, Gentiopicroside low does group. C,Gentiopicroside high does group. D, Cyclophosphamide group.Figure 2 Effects of gentiopicroside on the expressions of p-PI3K and p-Akt in tumor tissues of mice in each group by Western blot

3 討論

肝癌起病隱匿,多數患者被確診時已處于晚期,失去了手術治療的最佳機會。 傳統中藥由于毒副作用低、療效確切,具有多靶點、多途徑等優勢,在肝癌治療領域逐漸引起了人們的關注[8]。 本研究選擇的陽性藥物環磷酰胺為臨床治療肝癌常用的化療藥物,具有抑制腫瘤生長及抗血管生成作用,免疫抑制、骨髓抑制等毒副作用較常見[9]。 本研究結果發現,與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠的瘤重均降低,提示龍膽苦苷對H22肝癌小鼠的腫瘤生長具有抑制作用;同時,龍膽苦苷低、高劑量組小鼠胸腺指數及脾指數升高,而環磷酰胺組小鼠胸腺指數及脾指數降低,提示龍膽苦苷的抗腫瘤作用與提高免疫力有關。 IFN-γ 與IL-2 等細胞因子在調節免疫以及腫瘤免疫反應調節中起重要作用,與非特異性免疫系統中的 NK 細胞關系密切[10]。 INF-γ 具有廣泛的免疫調節作用,是一種高效的抗腫瘤生物活性物質,可由活化的T 淋巴細胞產生[11]。 IL-2 能誘導機體抗腫瘤免疫反應,是腫瘤免疫治療的重要細胞因子;IL-2 也可以直接使瘤體消退或停止生長,從而達到抗腫瘤作用[12]。 H22肝癌小鼠經治療后,與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷組小鼠血清IFN-γ 及IL-2 含量均升高,而環磷酰胺組小鼠血清IFN-γ 及IL-2 含量降低,上述結果進一步表明,龍膽苦苷對H22肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用與增加血清IFN-γ、IL-2含量有關。

新生血管的生成一方面可以為腫瘤細胞的轉移提供通道,另一方面也可以為腫瘤的持續生長提供營養支持,對腫瘤的發生、發展及轉移具有重要意義[13]。 血管生成是一個多因子參與的復雜調控過程,抑制血管生成是抗腫瘤藥物研究的重要方向,羥基紅花黃色素A 及人參皂苷Rg3 等均可以抑制H22肝癌小鼠血管生成,進而發揮抗肝癌作用[14-15]。 bFGF、TGF-β 及 VEGF 等是腫瘤新生血管形成的標志蛋白,其中bFGF 能夠刺激內皮細胞內纖維蛋白酶和膠原蛋白酶的生成,進而促進新血管的生成;TGF-β 主要的作用為促進內皮細胞的增殖與分化,是腫瘤惡化的重要指標;VEGF 是最有效的促血管生成因子,對淋巴管的形成、血管的滲漏以及內皮細胞的增殖均有促進作用[16-17]。 多項研究已證實[18-19],降低 bFGF、TGF-β 及 VEGF 表達可以有效抑制血管生成。 本研究結果同樣發現,與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠瘤組織 bFGF、TGF-β 及 VEGF 表達均降低,提示龍膽苦苷對H22肝癌小鼠血管生成具有抑制作用。 PI3K/Akt 信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑,阻斷該通路的激活可以下調bFGF、TGF-β 及 VEGF 的表達,進而抑制血管新生[20-22]。 本研究結果發現,與H22肝癌模型組比較,龍膽苦苷低、高劑量組及環磷酰胺組小鼠瘤組織p-PI3K 及p-Akt表達均降低,表明龍膽苦苷對H22肝癌小鼠血管生成的抑制作用與抑制PI3K/Akt 信號通路的活化有關。

綜上所述,本研究證實龍膽苦苷對H22肝癌小鼠腫瘤生長及血管生成均有抑制作用,該作用與提高免疫力,增加血清IFN-γ、IL-2 含量及抑制PI3K/Akt 信號通路的活化有關。